Toll樣受體激活對間充質干細胞免疫調節功能的影響

孫 玥 耿林玉 黃賽賽 王 紅 丁從珠

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是中胚層系的起源細胞,具有自我更新、多向分化、支持造血和組織修復的潛能。同時,MSC具有強大的免疫抑制功能,可以對體內多種免疫細胞發揮調節作用[1]。因此,在自身免疫性疾病的治療方面,MSC具有潛在的治療價值與廣闊的應用前景。

許多體內外實驗均證實MSC的免疫調節功能受外源性刺激的影響[2]。在某些情況下,由于機體內環境因子的不適刺激,MSC可能并不能有效發揮免疫調節功能。在機體內環境中,Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)刺激信號會影響MSC的免疫調節功能[3]。MSC表達多種功能性的TLR,很多研究證實TLR及其配體可以影響MSC的多種細胞功能包括細胞增殖、分化、遷移和免疫調節等[4]。有研究顯示,TLR4或TLR3的激活通過下調Jagged1表達,降低骨髓MSC對淋巴細胞增殖的免疫調節作用[5]。但是也有研究發現,通過誘導吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)產生,TLR3或TLR4激活增強了骨髓MSC的免疫調節功能[6]。

近年來研究顯示,與骨髓MSC比較,臍帶來源的MSC在臨床治療方面可能更有優勢[7]。本研究觀察了TLR4或TLR3激活對臍帶、骨髓兩種不同來源MSC免疫調節功能的影響,同時分析了兩種MSC中TLR4和TLR3的基礎表達情況。

材料與方法

1.試劑及儀器:DMEM-F12培養基、RPMI 1640培養基與胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Gibco公司。人外周血淋巴細胞分離液購自挪威Axis-Shield公司。TLR4、TLR3流式抗體與熒光染料CFSE購自美國eBioscience公司。TLR4激動劑脂多糖(LPS)、TLR3激動劑聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid, Poly(I:C)]購自美國Sigma公司。抗人CD3、CD28抗體購自美國eBioscience公司。Trizol、PrimeScriptTMRT與SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。CO2培養箱購自美國Sheldon公司。CIMO超凈工作臺購自上海新苗醫療器械制造有限公司。倒置顯微鏡(CKX53)購自日本Olympus公司。FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司。Step-one PlusTM熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

2.MSC分離培養:實驗中骨髓來自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院骨科關節置換術患者,臍帶來自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院婦產科健康產婦。實驗中所需外周血來自于健康志愿者。所有實驗均得到南京大學醫學院附屬鼓樓醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:2021-544-01),本研究獲得研究對象的知情同意。將關節置換術中所得松質骨碎片及骨髓液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)充分沖洗,離心后用紅細胞裂解液裂解,裂解充分后加入PBS混勻,有效離心半徑15cm,1500r/min離心5min,棄上清,PBS重復洗滌1次,完畢后將細胞用含10%FBS的DMEM-F12完全培養基混勻,以105個/毫升的密度種植。細胞放置于37℃的5% CO2培養箱培養,待細胞長到80%左右融合時傳代。實驗中所用3例骨髓MSC為P3代。臍帶無菌采集后,于DMEM-F12完全培養基4℃保存,在24h內處理。無菌狀態下,采用無菌器械去除靜脈及動脈,分離剝取臍帶中的華通氏膠。采用貼壁法,將膠組織剪成約1mm3的小塊接種入10cm培養皿中,靜置5min至組織塊黏合培養瓶/皿壁充分時,緩慢加入DMEM-F12完全培養基,置于溫度37℃、5% CO2的孵箱中。倒置顯微鏡下觀察細胞生長至80%融合時傳代。實驗中所用3例臍帶MSC為P3代。

3.細胞處理:本實驗中,將臍帶或者骨髓MSC以每孔5×104個的密度種植于24孔板,培養上清均為500μl,細胞貼壁后分別加入LPS、Poly(I:C)刺激處理,LPS刺激濃度為10ng/ml,Poly(I:C)刺激濃度為1μg/ml,處理時間為24h,同時留取未刺激處理的MSC組。細胞實驗分組為:①外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)單獨組(PBMC);②MSC與PBMC共培養組(+MSC);③LPS預處理MSC與PBMC共培養組(+LPS預處理MSC);④Poly(I:C)預處理MSC與PBMC共培養組[+Poly(I:C)預處理MSC]。

4.MSC調節PBMC增殖實驗:LPS、Poly(I:C)刺激實驗結束后PBS洗滌MSC,然后接種PBMC細胞懸液共培養。人淋巴細胞分離液(1.077g/ml)分離健康志愿者外周血PBMC,5μmol/L CFSE 37℃染色10min后,用4℃的RPMI 1640完全培養基終止反應5min,1500r/min離心10min,棄上清。RPMI 1640完全培養基混勻PBMC,加入2μg/ml的抗CD3/CD28抗體刺激淋巴細胞增殖,PBMC以每孔5×105個的細胞數量與MSC共培養。共培養4天后收集PBMC,流式細胞術檢測CFSE熒光衰減的百分率,即為細胞增殖百分率。

5.PCR檢測TLR4、TLR3基因水平:將臍帶MSC、骨髓MSC接種到6孔板,待細胞80%融合,胰酶消化,PBS洗滌收集細胞。用Trizol裂解液提取RNA后,用日本TaKaRa公司PrimeScriptTMRT試劑盒進行反轉錄。在Step-one PlusTM熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)。計算標準化后的2-ΔΔCt值表示mRNA的相對表達量。

6.流式細胞術檢測TLR4、TLR3蛋白水平:將臍帶MSC、骨髓MSC接種到6孔板,待細胞80%融合,胰酶消化,PBS洗滌收集細胞。流式細胞術檢測TLR4、TLR3的蛋白水平,以幾何平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)分析統計。

結 果

1.LPS或Poly(I:C)預處理對骨髓MSC免疫調節功能的影響:分別以TLR4激動劑LPS、TLR3激動劑Poly(I:C)預處理骨髓MSC 24h,觀察TLR激活對骨髓MSC調節PBMC增殖的影響。結果顯示,與單獨培養的PBMC增殖情況比較,未處理的骨髓MSC、Poly(I:C)預處理的骨髓MSC均可以顯著抑制PBMC增殖(P<0.05),但是LPS預處理的骨髓MSC并不能有效抑制PBMC增殖(P>0.05)。與未處理的骨髓MSC比較,LPS預處理的骨髓MSC抑制PBMC增殖的能力顯著下降(P<0.05),詳見圖1。

圖1 LPS或Poly(I:C)預處理對骨髓MSC免疫調節功能的影響A.各組PBMC增殖的流式圖;B.各組PBMC增殖百分率比較。*P<0.05,n=3

2.LPS或Poly(I:C)預處理對臍帶MSC免疫調節功能的影響:除了骨髓來源的MSC,臍帶來源的MSC也具有強大的免疫調節功能,可以抑制淋巴細胞增殖。本實驗以臍帶MSC為研究對象,繼續觀察LPS、Poly(I:C)激活TLR對臍帶MSC調節PBMC增殖的影響。結果顯示,與單獨培養的PBMC比較,未處理的臍帶MSC、LPS預處理的臍帶MSC與Poly(I:C)預處理的臍帶MSC均可以顯著抑制PBMC增殖(P<0.05)。同時,與未處理的臍帶MSC比較,LPS或者Poly(I:C)預處理的骨髓MSC抑制PBMC增殖的能力比較,差異無統計學意義(P>0.05),詳見圖2。

3.臍帶MSC與骨髓MSC的TLR表達水平:本研究進一步比較了骨髓和臍帶兩種不同來源MSC中TLR4和TLR3的基礎表達量。RT-qPCR檢測結果顯示,與骨髓MSC比較,臍帶MSC中TLR4、TLR3的基因相對表達量較低(P<0.05),詳見圖3中A、B。本研究通過流式細胞術檢測MFI,分析臍帶MSC與骨髓MSC中TLR4、TLR3的蛋白表達水平。與基因檢測結果一致,流式細胞術檢測結果顯示,與骨髓MSC比較,臍帶MSC中TLR4、TLR3的蛋白表達水平明顯更低(P<0.05),詳見圖3中C、D。

圖3 臍帶MSC與骨髓MSC的TLR表達水平A.TLR4基因表達;B.TLR3基因表達;C.TLR4蛋白表達;D.TLR3蛋白表達。*P<0.05,n=3

結 果

MSC具有多種特征,這些特征使其成為免疫治療的理想候選細胞[8]。MSC表達低水平的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)Ⅰ類分子,不表達HLA Ⅱ類分子和共刺激分子,因此,MSC適用于異基因移植治療,大大拓寬了MSC的應用范圍。MSC的另一個主要特征是其具有強大的免疫調節作用,因而很多研究將MSC用于移植物抗宿主病、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡和類風濕關節炎等免疫相關疾病的治療[9]。

MSC可作用于固有免疫系統和適應性免疫系統,可抑制絲裂原(如植物凝集素、刀豆蛋白)或抗體(如抗CD2、抗CD3、抗CD28)刺激的淋巴細胞增殖[10]。MSC能夠通過直接細胞接觸或旁分泌效應釋放可溶性因子,如肝細胞生長因子、前列腺素E2、轉化生長因子、吲哚胺-2,3-雙加氧酶、一氧化氮、jagged1和白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)等,抑制淋巴細胞增殖[11]。

研究顯示,TLR刺激信號包括病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP),可能會極大地影響MSC的免疫調節特性,從而影響MSC的治療結果[4]。TLR是機體固有免疫系統的重要識別受體,是激活機體免疫反應的第一線,它可存在于細胞表面和細胞內部,識別PAMP或DAMP,引發后續的適應性免疫反應。MSC表達多種功能性的TLR亞型包括TLR1～TLR10,其中TLR3和TLR4在人類MSC中表達量相對較高[12]。研究發現,在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型中,TLR4激活后的骨髓MSC產生一氧化氮的能力降低,從而影響了骨髓MSC對EAE的治療效果[13]。另有文獻報道,LPS刺激骨髓MSC可增加其產生IL-6、IL-8等,并減弱骨髓MSC對淋巴細胞的抑制效應,但是Poly(I:C)刺激骨髓MSC卻可使其免疫抑制效應增強[14]。

與骨髓來源的MSC比較,臍帶MSC更容易獲得,并表現出更高的增殖效率,所以臍帶MSC已被越來越多的研究人員考慮使用。本研究評估了TLR激動劑LPS或Poly(I:C)預處理,是否會導致骨髓或臍帶MSC免疫調節功能的異常,同時還評估了臍帶MSC和骨髓MSC之間TLR3和TLR4的表達是否存在顯著差異。實驗結果表明,與骨髓MSC比較,臍帶MSC對LPS或Poly(I:C)的刺激存在明顯的“抗性”,即LPS或Poly(I:C)刺激后對臍帶MSC抑制淋巴細胞增殖的影響并不顯著。本研究進一步分析顯示,臍帶MSC中,TLR3、TLR4的基因和蛋白表達水平均明顯低于骨髓MSC。這一結果與之前文獻報道的一致[15]。這部分解釋了兩種MSC對TLR刺激信號的不同反應。

既往文獻報道,骨髓MSC在骨髓細胞總量中占有的比例極低(0.001%～0.010%),并且骨髓MSC的細胞數量和增殖能力受年齡因素影響很大,隨著年齡增長其增殖能力明顯降低。臍帶MSC與骨髓MSC類似,同樣具有多向分化和免疫調節的功能,但是臍帶易于獲取而且資源豐富,細胞數量大,屬于醫療廢棄物,規避創傷性操作和倫理的束縛。目前MSC在動物實驗和臨床試驗中未達到穩定的免疫治療效果,可能與選取移植的MSC細胞來源相關。有些個案報道臍帶MSC的免疫調節功能可能優于同一個體的骨髓MSC[16]。臨床試驗也證實,在造血干細胞移植時合并臍帶MSC移植,與合并骨髓MSC移植比較,移植排斥事件的發生率更低。

綜上所述,本研究表明,與臍帶MSC比較,骨髓MSC的免疫調節功能更容易受到TLR激動劑刺激的影響,并且臍帶MSC中TLR的基礎表達量明顯低于骨髓MSC。因此,筆者團隊推測在MSC的免疫治療方面,臍帶MSC可能較骨髓MSC更有優勢,但仍然需要大規模的臨床試驗以進一步證實,從而優化MSC移植治療免疫相關疾病的策略。