喀什地區林奇綜合征錯配修復蛋白檢測分析

朱君玲，姜會娟，韓雯，李玉華

結直腸癌發病機制與遺傳因素和環境因素密切相關［1］。研究認為，白種人結直腸腫瘤的發生率更高［2］。也有研究發現，哈薩克族因其飲食習慣導致結直腸癌發生率較高［3］，而南疆地區大多數為維吾爾族，具有白種人血統且以肉食為主，導致其結直腸癌發病率較高。林奇綜合征作為一種遺傳性結直腸癌，同系家族發生率較高。其錯配修復（mis?match repair，MMR）蛋白包括MutL 同源物 1（hu?man mutL homolog 1，MLH1）、MutS 同源物2（MutS homolog 2，MSH2）、PMS1 同源物2（PMS1 homolog 2，PMS2）、MutS 同源物6（MutS homolog 6，MSH6），可修復脫氧核糖核酸（DNA）錯配堿基對，發揮修復基因損傷作用，而MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 功能異常可增加結直腸癌發生率［4-5］。本研究旨在分析喀什地區林奇綜合征患者MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白的表達情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年6 月至2020 年6 月在喀什地區第一人民醫院接受手術的300 例林奇綜合征患者的標本。300 例林奇綜合征患者中男性178 例，女性122 例；年齡21～92 歲［（56.11 ± 10.78）歲］；腫瘤部位：左半結腸癌97 例，右半結腸癌78 例，直腸癌125 例；腫瘤大小：≥5 cm 142 例，<5 cm 158 例；分化程度：低分化91 例，中分化99 例，高分化110 例；腫瘤形態：潰瘍型186 例，隆起型114 例；浸潤程度：漿膜外142 例，漿膜內158 例；有神經侵犯72 例，無神經侵犯228 例；有脈管侵犯75 例，無脈管侵犯225 例；有淋巴結轉移64 例，無淋巴結轉移236 例。納入標準：（1）符合《遺傳性結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》［6］中關于林奇綜合征的診斷標準；（2）經病理學檢查確診；（3）均行腸癌根治術；（4）均為維吾爾族；（5）臨床資料完整。排除標準：（1）腹膜轉移或遠端轉移；（2）活檢標本；（3）合并惡性腫瘤；（4）有嚴重肝腎疾病；（5）術前接受化療及放療。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準［2018 快審第（105）號］。

1.2 方法

1.2.1 MMR 蛋白檢測 采集患者手術切除的組織標本，使用4%的中性甲醛固定，石蠟包埋，切片。采用免疫組化法檢測MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白表達水平，按試劑盒說明書操作，抗體及試劑盒來自北京中杉金橋生物技術有限公司，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液，陽性對照采用正常結直腸黏膜上皮細胞。細胞核內有棕黃色或黃褐色顆粒判定為陽性，否則為陰性。MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白中任一蛋白表達為陰性即判定為錯配修復蛋白缺失（deficient mismatch repair，dMMR），全部陽性判定為錯配修復蛋白完整（proficient mismatch re?pair，pMMR）。根據林奇綜合征患者MMR 蛋白表達缺失情況將其分為dMMR 組和pMMR 組。

1.2.2 資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、腫瘤形態、浸潤程度、神經侵犯、脈管侵犯、淋巴結轉移等臨床資料。

1.2.3 隨訪及預后分析 術后對dMMR 組和pMMR 組患者隨訪觀察2 年，每3 個月電話、門診、復查隨訪1 次，記錄其生存情況。

1.3 統計學處理

應用統計學軟件SPSS 22.0 處理所得數據，計數資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗。計量資料以±s表示，采用t檢驗。采取Kaplan?Meier 法行生存分析。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 林奇綜合征患者MMR 蛋白表達情況

300 例林奇綜合征患者中，dMMR 發生率為16.67%（50/300），pMMR 發生率為83.33%（250/300），其中MLH1 蛋白表達缺失率為3.67%（11/300），MSH2 蛋白表達缺失率為8.00%（24/300），PMS2 蛋白表達缺失率為3.00%（9/300），MSH6 蛋白表達缺失率為2.00%（6/300），MLH1 和PMS2 蛋白表達缺失率為6.00%（18/300），MSH2 和MSH6蛋白表達缺失率為5.67%（17/300），MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白同時表達缺失率為1%（3/300）。根據林奇綜合征患者MMR 蛋白表達缺失情況將其分為dMMR 組（n=50）和pMMR 組（n=250）。

2.2 MMR 蛋白表達缺失與林奇綜合征患者病理特征的關系

dMMR 組與pMMR 組患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤形態、神經侵犯、脈管侵犯、淋巴結轉移比較差異無統計學意義（P>0.05）；dMMR 組患者腫瘤在右半結腸、分化程度低、浸潤至漿膜外中的占比高于pMMR 組（P<0.05）。見表1。

表1 MMR 蛋白表達缺失與林奇綜合征患者病理特征的關系［例（%）］

2.3 dMMR 組與pMMR 組患者生存率比較

在術后2 年的隨訪觀察中，dMMR 組有10 例失訪，pMMR 組有17 例失訪，dMMR 組2 年生存率為87.50 %（35/40），pMMR 組2 年 生 存 率 為72.10 %（168/233）。Kaplan?Meier 生存分析顯示，dMMR 組和pMMR 組患者的2 年生存率比較差異有 統 計 學 意 義（Log Rank=5.156，P=0.023）。見圖1。

注：dMMR 為錯配修復蛋白缺失，pMMR 為錯配修復蛋白完整

3 討論

結直腸癌為消化道常見的惡性腫瘤。隨著生活方式和飲食方式的改變，結直腸癌的發病率及死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著患者的生命健康［7］。結直腸癌臨床表現不明顯，早期患者無明顯癥狀，發現時往往處于腫瘤晚期，導致其預后較差［8］。目前放化療、手術治療、靶向治療等治療方法可延長患者生存期及改善生存質量，但某些患者對目前的治療方式存在不敏感現象，故結直腸癌治療靶點及有效性篩查對提高其診療精準性具有重要價值［9］。結直腸癌根據發病特點可分為散發性和遺傳性，林奇綜合征是遺傳性結直腸癌中較為特殊的一種類型，為MMR 蛋白突變而形成的一種顯性遺傳性疾病。目前通過MMR 蛋白檢測可發現dMMR而確診林奇綜合征，有助于家族遺傳篩查［10］。目前臨床上主要采用免疫組織化學法和聚合酶鏈式反應檢測MMR 蛋白表達情況，前者檢測簡單快捷，后者為MMR 蛋白檢測的金標準，能夠更加客觀地評估功能性dMMR，但是對實驗室條件要求高且價格相對昂貴。隨著科學技術的發展，二代測序是近年來出現的新的檢測方法。早期應用免疫組化分析MMR 蛋白的研究主要集中在MLH1 和MSH2 上，但研究顯示其在篩選林奇綜合征患者時敏感度和特異度不高，檢測MLH1 和MSH2 蛋白無法完全預測林奇綜合征的基因突變［11］。隨著研究的進展，MLH1 和MSH2 蛋白聯合PMS2 和MSH6 蛋白檢測可有效提高MMR 蛋白的預測價值，與微衛星不穩定性檢測效果相當［12］。吳暢等［13］在對湖南地區的MMR 蛋白表達的研究中發現，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白表達缺失率分別為8.90%、2.60%、14.70%、2.60%；在歐洲的一項研究中，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋 白 表 達 缺 失 率 分 別 為15.00%、21.00%、15.00%、13.00%［14］；而韓國的一項研究中，MLH1、MSH2、MSH6 蛋白表達缺失率分別為3.70%、2.00%、5.20%［15］。目前報道的MMR蛋白缺失率與本研究結果存在一定差異，表明dMMR 可能和生活方式、病理特征、遺傳及地理等因素有關。本研究中MLH1 和PMS2 蛋白表達缺失率為6.00%，MSH2 和MSH6 蛋白表達缺失率為5.67%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白同時表達缺失率為1%，說明MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6蛋白可能存在共同缺失的情況，分析原因可能是有多個分子和酶參與MMR 蛋白修復DNA 的過程，MLH1 和MSH2 蛋白通過與同源性MMR 蛋白形成二聚體發揮主要作用，MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6 蛋白之間能夠分別合成功能性二聚體復合物。MLH1 和MSH2 蛋白屬于主導蛋白，PMS2 和MSH6 蛋白屬于配對蛋白，MLH1 和MSH2 蛋白發生突變后二聚體蛋白降解，從而使MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6 蛋白表達缺失［16］。

在分析MMR 蛋白表達缺失與林奇綜合征患者病理特征的關系時發現，2 組患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤形態、神經侵犯、脈管侵犯、淋巴結轉移比較差異無統計學意義，說明MMR 蛋白突變發生在腫瘤的早期階段，與上述病理特征沒有顯著相關性。而右半結腸癌患者dMMR 的發生率更高，考慮可能與生理功能、胚胎來源及血管供應等生物學和臨床差異有關［17］。左半結腸癌與右半結腸癌的發生發展本身不太一樣，右半結腸毛細血管豐富、血液供應充足，同時腸腔較左半結腸大，壁薄擴張、離子交換、基因突變都更容易［18］。dMMR 患者腫瘤分化程度更低，說明中低分化的腫瘤更容易出現dMMR，導致錯配概率增加，加速癌細胞增殖分裂，從而加劇腫瘤惡化。dMMR 與腫瘤浸潤程度也有一定關系，PMS2 蛋白缺失的患者浸潤至漿膜外更多，可能是因為癌組織侵犯范圍增加，導致MMR 蛋白缺失增多，腫瘤的發展更加嚴重。但也有研究顯示［19-24］，dMMR 與性別、腫瘤大小、淋巴結轉移等有一定關系，與本研究結果存在一定差異，考慮可能與選取的樣本間差異有關。另外，本研究顯示，dMMR 患者的生存率顯著高于pMMR 患者，與趙輝等［25］的研究結果較為一致，但現階段關于MMR 蛋白影響患者預后的具體機制尚不清楚。本研究中dMMR 患者預后較好，推斷可能與腫瘤組織中二氫嘧啶脫氫酶和胸苷合成酶過表達及免疫監視功能增強有關。

綜上所述，MMR 蛋白與林奇綜合征的發生發展密切相關，林奇綜合征患者中常見MMR 蛋白缺失，檢測MMR 蛋白能夠早期診斷dMMR，對林奇綜合征進行預測，在患者治療方案的選擇及預后分析中有著重要意義。