蓮生物堿生物合成途徑及相關基因研究進展

王玲 卓燊，2 付學森 劉紫璇 劉笑蓉，3 王志輝，3 周日寶，3，4劉湘丹，3，4

（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；2.廣西科技大學醫學部，柳州 545006；3.湘產大宗道地藥材種質資源及規范化種植重點研究室，長沙 410208；4.湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，長沙 410208）

蓮Nelumbo nuciferaGaertn.為蓮科多年生水生植物［1］，作為藥用植物最早以藕實莖之名記載于東漢《神農本草經》、明代《本草綱目》中對蓮各部位名稱進行了詳細的解釋［2］。蓮的葉、種子、種子中的幼葉和胚根、雄蕊、蓮蓬等多個部位均可入藥，其種子作蓮子入藥，有補脾止瀉、止帶、益腎澀精、養心安神之功效，為藥食同源佳品；其干燥葉作荷葉入藥，有清暑利濕、升發清陽、涼血止血等功效；其成熟種子中干燥的幼葉和胚根作蓮子心入藥，重在清心安神、交通心腎［3］等。蓮子、荷葉、蓮子心基原相同而因入藥部位不同導致功效不同稱“同源異效”即藥效分化，其中荷葉、蓮子心均含生物堿類和黃酮類成分而藥效差異顯著引起了筆者的關注。

現有認知物質基礎不同可能導致功效和藥理作用差異。現代化學成分研究表明，荷葉和蓮子心均含有生物堿類和黃酮類成分，但兩者生物堿類成分［4-8］差異明顯。荷葉、蓮子心所含生物堿均屬于芐基異喹啉類生物堿（benzylisoquinoline alkaloids, BIAs）。但荷葉中生物堿主要是阿樸啡類（aporphines），藥典將其中的荷葉堿（nuciferine）設為荷葉評價指標，規定其含量不得少于0.1%［3］；此外番荔枝堿（anonaine）、O-去甲基荷葉堿（O-nornuciferine）、蓮堿（roemerine）、N-去甲基荷葉堿（N-nornuciferine）在荷葉中含量也相對豐富；現代研究表明，阿樸啡類生物堿荷葉堿調脂減肥作用明顯［9］，與《本草綱目》記載“荷葉服之，令人瘦劣”的功效相符。蓮子心生物堿主要為雙芐基異喹啉類（bisbenzylisoquinolines），該類成分被認為是蓮子心具有安神功效的主要藥效物質，其中甲基蓮心堿（neferine）具有抗心律失常、抗高血壓、抗血栓等作用［10］，藥典將其作為蓮子心質量評價指標，規定其含量不得少于0.7%［3］；蓮子心中還含具有降壓作用的異蓮心堿（isoliensinine）［11］及抗氧化作用的蓮心堿（liensinine）等。

蓮中生物堿類成分具有顯著藥理活性，而荷葉與蓮子心的“同源異效”現象，激發越來越多研究工作者開展蓮生物堿生源合成途徑及關鍵酶研究。基于此，本文通過查閱文獻對蓮生物堿成分類型、蓮生物堿合成途徑及其關鍵酶基因進行了綜述，并對蓮中主要的生物堿合成途徑進行歸納，以期為解析蓮的生物堿合成途徑及荷葉、蓮子心的藥效分化的分子機制提供參考。

1 蓮的生物堿分類及主要成分

蓮生物堿按母核連接的差異基團，分單芐基異喹啉類、雙芐基異喹啉類、原阿樸啡類、阿樸啡類、氧化阿樸啡類、去氫阿樸啡類和其他類［12］，以單芐基異喹寧類、雙芐基異喹寧類和阿樸啡類這三類為主。荷葉中生物堿以阿樸啡類、單芐基異喹啉類為主，如荷葉堿、蓮堿、O-去甲基荷葉堿、番荔枝堿、N-去甲基荷葉堿等。蓮子心中生物堿以雙、單芐基異喹啉類為主，主要包括蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿等。蓮中常見生物堿見表1，化學結構見圖1。

圖1 蓮中主要生物堿化學結構Fig.1 Chemical structure of main alkaloids in lotus（Nelumbo nucifera Gaertn.）

表1 荷葉、蓮子心主要化學成分Table 1 Main chemical constituents of lotus leaf and lotus plumule

2 蓮的生物堿生物合成途徑

2.1 BIAs的分類及蓮生物合成途徑

2.1.1 BIAs的分類及其共有生物合成途徑 BIAs按母核分類如下［30-31］：（1）芐基異喹啉生物堿（benzylisoquinoline），如罌粟堿；（2）雙芐基異喹啉生物堿，如蓮心堿、甲基蓮心堿；（3）阿樸啡和異阿樸啡類生物堿，如荷葉堿、番荔枝堿；（4）小檗堿和原小檗堿類生物堿（protoberberine），如黃連堿、小檗堿；（5）苯并菲啶類生物堿（benzophenanthridines），如血根堿；（6）嗎啡類生物堿（morphinane），如嗎啡；（7）普羅托品類生物堿（protopine）。

BIAs具有共有合成途徑，以氨基酸為生物合成起點，經一系列轉移酶、還原酶及合成酶催化衍生出各類芐基異喹啉類生物堿。首先，酪氨酸（L-tyrosine）經反應分別形成L-多巴胺（L-dopamine）和4-羥基苯基乙醛（4-hydroxyphenylacrtaldehyde，4-HPAA），隨后多巴胺和4-HPAA經去甲烏藥堿合酶（norcoclaurine synthase，NCS）催化縮合形成（S）-去甲烏藥堿，（S）-去甲烏藥堿［32］再經（S）-去甲烏藥堿6-O-甲基轉移酶（（S）-norcoclaurine-6-O-methyltransferase，6OMT）、烏藥堿N-甲基轉移酶（coclaurine-N-methyltransferase，CNMT）、3'-羥基-N-甲基烏藥堿-4'-O-甲基轉移酶（4'-O-methyltransferase, 4' OMT）3個甲基轉移酶的甲基化和細胞色素P450氧化還原酶（N-methylcoclaurine-3'-hydroxylase,NMCH）的催化形成（S）-牛心果堿（（S）-reticuline）［33］。以（S）-牛心果堿為前體，經異構、甲基化、去甲基化、偶聯、重排等反應，可形成阿樸啡類、雙芐基異喹啉類、小檗堿和原小檗堿類等大多數BIAs。其中（1）小檗堿類途徑，小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme，BBE）催化（S）-reticuline形成（S）-金黃紫堇堿（（S）-scoulerine），在金黃紫堇堿9-O-甲基轉移酶（scoulerine 9-O-methyltransferase，SOMT）、四氫小檗堿合酶（Canadine synthase，CAS）、四氫小檗堿氧化酶（（S）-tetrahydroprotoberberine oxidase, STOX）催化下形成小檗堿等小檗堿類。（2）（S）-金黃紫堇堿也是芐基異喹啉類、苯并菲啶類、普羅托品類的共同起點［34-35］，（S）-金黃紫堇堿經反應形成普羅托品類，苯并菲啶類再在普羅托品類基礎上經反應形成［35］。（3）嗎啡類途徑，（S）-牛心果堿在異構酶（reticuline epimerase,REPI）異構作用下形成（R）-牛心果堿［36］，再經P450 酶（salutaridine synthase）偶聯作用形成嗎啡烷的基本骨架，而后反應形成嗎啡類生物堿［37］。（4）阿樸啡類途徑，（S）-Reticuline經紫堇塊莖堿合成酶（corytuberine synthase，CTS）催化發生分子內C-C苯酚偶聯轉化成紫堇塊莖堿后進一步合成阿樸啡類［38］。（5）雙芐基異喹啉類途徑，由CYP80A催化（S）-N-甲基烏藥堿反應產生雙芐基異喹啉。目前，小檗堿、嗎啡、血根堿、木蘭花堿等成分合成途徑已明確，而蓮中的生物堿的合成途徑并不清晰。共有合成途徑如圖2所示。

圖2 芐基異喹啉類生物堿合成途徑Fig.2 Synthesis pathways of benzylisoquinoline alkaloids

2.1.2 蓮的生物堿生物合成途徑 文獻研究發現，蓮中生物合成途徑研究主要集中在阿樸啡類和雙芐基異喹啉類生物堿，與大多數BIAs合成途徑相似，蓮生物堿也具有共同合成途徑。目前，阿樸啡類途徑存在較多爭議，因荷葉所含阿樸啡類生物堿的C-3'和C-4'不含甲基或羥基，故有研究者認為該類成分應該是（S）-N-甲基烏藥堿或者（S）-去甲烏藥堿由CYP80G催化產生；但也有認為從（S）-牛心果堿處經CTS催化生成紫堇塊莖堿再產生一系列的阿樸啡類。此外，蓮堿可能是由北美鵝掌楸尼定堿在CYP719A的催化下生產，N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿可能是荷葉堿去甲基化修飾產生。荷葉中的荷葉堿、蓮堿、番荔枝堿、N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿合成途徑，如圖3所示。

圖3 荷葉阿樸啡類生物堿合成途徑Fig.3 Synthesis pathways of apomorphine alkaloids in lotus leaf

蓮中雙芐基異喹啉類生物堿可能從（S）-N-甲基烏藥堿處由CYP80A催化兩個單芐基類生物堿的C-O之間發生C-O 苯酚偶聯反應產生。從結構分析，蓮心堿可能由亞美罌粟堿和（S）-N-甲基烏藥堿反應生成，甲基蓮心堿可能由蓮心堿經甲基化修飾產生，異蓮心堿可能由兩種構型的N-甲基烏藥堿反應生成norisoliensinine后經甲基化修飾而產生。蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿合成途徑如圖4。

圖4 蓮子心雙芐基異喹啉類生物堿合成途徑Fig.4 Synthesis pathways of dibenzyl isoquinoline alkaloids in lotus plumule

2.2 蓮生物堿合成途徑中相關酶基因進展

文獻研究發現，蓮生物堿合成途徑對NCS、6OMT、7OMT、NCMT、CYP80A、CYP80G、CYP80B酶基因研究較多，主要集中在蓮不同組織不同發育階段相關酶基因的表達模式與生物堿含量的變化關系研究，而相關酶功能研究較少。

2.2.1 去甲烏藥堿合成酶基因 去甲烏藥堿合成酶（NCS）是芐基異喹啉類生物堿共有合成途徑中的第一個關鍵酶，屬于裂合酶［35,39］。NCS催化多巴胺和4-羥基苯乙醛縮合生成BIAs合成路徑中的第一個前體化合物去甲烏藥堿，去甲烏藥堿是生成阿樸啡類、嗎啡類等生物堿的重要前體物質，NCS為以上生物堿生源合成途徑中重要限速酶［40-41］。

Vimolmangkang等［39］鑒定出7個NCS候選基因，命名為NnCNS1-NnCNS7。基因NnCNS7被認為是參與蓮葉生物堿合成途徑中的關鍵基因，在蓮葉中顯著表達且表達水平與生物堿含量相關；當生物堿含量較高時可通過反饋機制抑制NnNCS7的表達，水平低時則反之。趙力［42］進一步研究基因NnNCS7在‘Luming’（高BIAs品種）和‘WD40’（低BIAs品種）兩個品種葉片的7個發育階段（S1-S7）表達模式發現，該基因在兩個品種的發育階段表達模式相似，S4階段的表達水平達到極值，且生物堿合成途徑中基因的表達峰值先于生物堿積累峰值。7個CNS基因中，基因NnCNS4的表達缺乏不會抑制蓮葉生物堿的積累，與蓮中生物堿的積累無顯著相關性；此外，在蓮葉、花、葉柄中未檢測到基因NnCNS6的轉錄本，認為其為一假基因［39］。

此外，朱玲平［43］根據“中國古代蓮”基因組注釋信息，篩選出3個與罌粟高度同源的NCS候選基因，命名為NnCNS1、NnCNS2、NnCNS3。對候選基因在‘露茗蓮’（高荷葉堿品種）和‘10-48’（低荷葉堿品種）兩個品種葉片進行表達分析研究發現，基因NnCNS1、NnCNS2在兩個品種葉片中的表達差異可能導致了兩個品種葉片中總生物堿含量差異，其可能參與蓮葉片中含量較高的荷葉堿、O-去甲基荷葉堿的合成；而NnCNS3表達差異對兩個品種葉片荷葉總生物堿含量差異的影響不明顯，可能參與葉片中含量較低的番荔枝堿、蓮堿、N-去甲基荷葉堿的合成［43］。

2.2.2 甲基轉移酶基因 甲基轉移酶包括O-甲基轉移酶（OMT）和N-甲基轉移酶（NMT）兩類，多數甲基轉移酶具有底物專一性，有的可以同時催化多個位點發生甲基化［44］。甲基化可以發生在含有羥基的C-6、C-7、C-4'以及含氫的N，催化反應發生的酶主要有6OMT、7OMT（7-O-甲基轉移酶）、4'OMT、CNMT［45］。

6OMT主要使（S）-去甲烏藥堿C-6位的羥基發生甲基化生成（S）-烏藥堿，也可催化其他芐基喹啉結構的C-6位發生甲基化，可能在蓮BIAs生成中發揮了重要的修飾作用。單鋒［4］發現3個6OMT的同源基因（Nn6OMT1、Nn6OMT2、Nn6OMT3）在蓮葉、蓮子心不同發育時期的表達與生物堿成分的積累呈正相關。在蓮葉發育早期三者表達水平達峰值，中后期表達下降，生物堿成分的積累趨勢與之相同。在蓮子心4個發育時期（LP0-LP3）的表達呈先升高后降低的趨勢，LP2期達峰值；生物堿積累在LP0期極少，LP1-LP2期逐漸增加，LP3期不在增加。

7OMT催化雙芐基異喹啉或阿樸啡類的C-7甲基化反應，Deng等［46］在蓮中鑒定出3個7OMT基因（Nn7OMT1、Nn7OMT2、Nn7OMT3）在蓮葉中顯著表達。4'OMT可催化（S）-甲基烏藥堿甲基化生成（S）-番荔枝堿，其過表達對生物堿含量沒有影響［47］。系統進化分析表明6OMT與7OMT同處于一個分支，4'OMT與它們不在同一基因簇。

CNMT可以使（S）-烏藥堿發生N-甲基化生成（S）-N-甲基烏藥堿，具有底物的多樣性。單鋒［4］研究發現基因NnCNMT1在蓮葉中顯著表達，但是在蓮子心中表達極低，在荷葉中的表達隨荷葉的生長發育而升高。其他研究發現3個基因NnCNMT1、NnCNMT2、NnCNMT3，基因NnCNMT2被認定為假基因，通過機械損傷模型研究時發現CNMT可能是荷葉生物堿合成途徑中的一個關鍵酶，在荷葉堿合成中發揮了重要作用［48］。

2.2.3 細胞色素P450酶基因 細胞色素P450（cytochrome P450 monooxygenas，CYP450）屬于氧化酶，可催化亞甲基雙氧橋結構的形成，也可使底物發生羥基化、去甲基化反應，具有底物專一性［49］。參與蓮BIAs合成途徑的CYP450可能有CYP80和CYP719兩個家族［50］，其中CYP80主要包含CYP80G、CYP80A和CYP80B。

CYP80G可催化（S）-番荔枝堿分子內C-C苯酚偶聯轉化成紫堇塊堿進一步合成阿樸啡類［36］，可能參與蓮阿樸啡類生物堿合成。單鋒［4］對不同發育時期荷葉、蓮子心BIAs候選基因表達與化學成分相關性開展研究，發現基因NnCYP80G在荷葉中顯著表達。該基因在荷葉不同發育階段的表達趨勢與化學成分的積累趨勢一致，其在荷葉發育早期高表達，中后期表達下降；阿樸啡類成分在荷葉發育早期大量積累，中期增加不明顯，后期出現下降［4］。Meelaph等［48］也發現基因NnCYP80G在荷葉中高水平表達，機械損傷可以誘導該基因在荷葉中的表達和芐基異喹啉生物堿的積累。

CYP80A可能催化單芐基異喹啉類生物堿C-O之間發生C-O苯酚偶聯反應參與蓮雙芐基異喹啉生物堿合成。趙力［42］研究發現基因NnCYP80A在蓮子心中高度表達但葉片中表達量非常低，檢測到雙芐基異喹啉類生物堿在蓮子心中積累而葉片中積累量較少。單鋒［4］發現該基因的表達規律與蓮子心中雙芐基異喹啉生物堿的變化規律呈正相關，雙芐基異喹啉類成分積累隨NnCYP80A的表達而增加，發育后期其不表達，雙芐基類成分的積累也不再增加。同時也發現在不同組織中具有表達差異（蓮子心中高表達）。

CYP80B負責C-3'的羥基化、甲基化。可能有3個CYP80B候選基因（CYP80B1、CYP80B2、CYP80B3）與蓮生物堿合成有關，CYP80B1、CYP80B3可能參與荷葉中的荷葉堿合成；CYP80B2可能參與番荔枝堿的合成［43］。

CYP719A亞族可催化亞甲基二氧基橋結構的形成，該家族基因NnCYP719A22可能涉及蓮阿樸啡類生物堿合成，與番荔枝堿、蓮堿的形成相關［42,50］。

2.2.4 其他酶基因 Yang 等［47］在蓮中發現編碼SOMT、CODM（可待因脫氧甲基化酶，CodeineO-demethylase）和T6ODM（蒂巴因6-去氧甲基化酶，thebaine 6-O-demethylaseT）的同源物，它們具有去甲基化的作用。其中有3個編碼SOMT的基因與原小檗堿生物堿途徑相關，1個編碼CODM的基因和2個編碼T6ODM的基因參與嗎啡類生物堿途徑。目前沒有從蓮中分離出有相關的嗎啡類化學成分［51］，故需要更多的研究來闡明以上酶是否參與蓮生物堿的合成。

3 結論與展望

文獻研究發現，蓮生物堿生源合成研究主要集中在酶基因在蓮不同組織的表達量與生物堿含量相關性研究方面。目前，NCS、6OMT、7OMT、NCMT、CYP80A、CYP80G、CYP80B酶基因已從蓮BIAs生物堿合成途徑中被發現，其中同源基因NnCYP80A和NnCYP80G功能分化且在荷葉和蓮子心中差異表達，NnCYP80A在蓮子心中顯著表達，可能與雙芐基類生物堿產生相關，而NnCYP80G則可能與阿樸啡類合成相關。此外，甲基轉移酶的修飾在豐富蓮BIAs的方面發揮了重要作用。隨著蓮不同部位和不同發育時期化學成分的逐步解析，以及越來越多生物合成途徑相關酶及基因的發現，推進蓮生物堿生物合成途徑的闡析、開發高生物堿含量新品種，尚有幾個關鍵問題待進一步研究和解決。

首先，蓮中生物堿合成途徑中相關酶基因具體功能不明確。闡明蓮中BIAs生物合成途徑，進行關鍵酶基因功能分析非常必要，而現階段僅有3個參與蓮生物堿合成的O-甲基轉移酶功能被表征［52-53］。值得注意的是甲基化對BIAs結構和功能的多樣性至關重要，甲基轉移酶（6OMT、7OMT、NCMT）的甲基化修飾和一些酶的去甲基化作用豐富了蓮中BIAs的種類，因此蓮甲基轉移酶的具體功能研究是蓮關鍵酶基因功能研究的一個重點。目前，基因過表達、基因敲除技術、RNA干擾和反義技術等在植物基因功能驗證技術非常成熟并已得到廣泛應用［54］，后續可運用以上相關技術對蓮生物堿合成途徑中的相關酶及基因進行功能驗證分析，為闡明蓮生物堿生物合成途徑提供研究基礎。第二，有研究表明生物堿的生物合成和積累發生在植物的所有器官中，目前對蓮生物堿生物合成細胞定位研究關注較少。Deng等［55］推測蓮中雙芐基異喹啉類生物堿主要在荷葉中合成后通過韌皮部易位作用經乳汁轉移到蓮子心中。由于植物中不同酶的作用以及不同外在環境的差異，植物不同部位合成的生物堿具有不同的結構，因此，多組學聯合對蓮生物堿生物合成進行細胞定位研究有助于解析其合成機制。第三，轉錄因子可以調控生物堿的生物合成，研究表明轉錄因子對蓮中BIAs的積累具有調控作用［42,56］，目前在蓮中已發現了WRKY、bHLH等轉錄因子［42］，但尚不能解析蓮生物堿生物合成途徑中的轉錄調控機制，需進一步研究調控蓮生物堿生物合成的關鍵調控因子，以實現目標次生代謝產物（如荷葉堿）的大量合成與積累。最后，荷葉、蓮子心的“同源異效”現象的生物合成分子機制有待深入研究，進一步對NnCYP80A、NnCYP80G酶基因進行功能驗證；同時通過代謝組學、轉錄組學等多組學方法分析挖掘荷葉、蓮子心生物堿合成途徑中差異成分的其他關鍵基因，從分子角度揭示荷葉、蓮子心生物堿成分差異的原因。