紅酵母基因組和代謝工程改造研究進展

李雨真 梅天秀 李治文 王淇 李俊 鄒岳 趙心清

（1.上海交通大學生命科學技術學院 微生物代謝國家重點實驗室 教育部代謝與發育國際科學國際合作聯合實驗室，上海 200240；2.伽藍（集團）股份有限公司，上海 200233）

紅酵母是一類能產紅色素酵母的總稱［1-2］，不是分類學的定義。紅酵母包括鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）和紅冬孢酵母屬（Rhodosporidiobolus）等不同屬的菌株，其中研究得較深入的是紅酵母屬，目前其分類還存在一定的爭議，有將其歸為擔子菌門（Basidiomycota）、銹菌綱（Urediniomycetes）、擔孢目（Sporidiales）、鎖擲酵母科（Sporidiobolaceae）［3］，也有歸為半知菌亞門（Deuteromycotina）、芽孢綱（Blastomycetes）、隱球酵母目（Cryptococcales）［4］。

特定環境有不同的紅酵母分布。根據目前的研究報道，我國淡水水域紅酵母主要有3個種，其中深紅酵母（R.rubra）是中國淡水紅酵母的優勢種，黏紅酵母（R.glutinis）次之，小紅酵母（R.minuta）數量最少［5］。而在世界各大洋和我國黃、渤海沿岸中分離的紅酵母主要有4個種，即深紅酵母（R.rubra）、黏紅酵母（R.glutinis）、小紅酵母（R.minuta）和牧草紅酵母（R.graminis），還報道從渤海海水中分離到了橙黃紅酵母（R.aurantiaca），其中深紅酵母是優勢菌，數量大大超過其他幾種紅酵母［6］。

紅酵母具有較強的環境適應力，廣泛分布于陸地、海洋、江河、湖泊等各種生態環境，因具有生產多種營養物質和生物活性物質的能力而得到廣泛研究，是具有很大潛力的工業生產菌株。紅酵母在養殖、食品、醫藥和化妝品等領域也有非常多的應用，是一類重要的酵母菌。近年來對紅酵母的研究逐漸深入，在基因組分析和關鍵酶研究、基因組編輯和遺傳工程改造等方面取得了良好進展，對構建高效紅酵母細胞工廠具有重要意義。本文對紅酵母的應用和研究進展進行了綜述，為未來更好利用紅酵母進行活性物質生產和應用提供基礎。

1 紅酵母的用途及其生產的活性物質

1.1 紅酵母的用途

紅酵母廣泛分布于海洋和海產動物體表及腸道內，因其易得、低成本的特點受到水產養殖者的青睞，被廣泛選用為魚、蝦、蟹、貝、海參等水產動物幼體浮游期的鮮活誘餌。例如，從不同海產動物腸道中分離得到的紅酵母RY4，經分子鑒定與膠紅酵母（R.mucilaginous）同源性較高，與其模式菌株ITS和26S rRNA基因序列相似度均超99%，在對蝦育苗期間多次添加高劑量或在幼體早期如無節Ⅳ期單次添加高劑量，可有效促進幼體變態與營養不足時的存活［7］。紅酵母（Sporidiobolus pararoseus）可作為一種抗生素生長促進劑（AGPs）的替代品加入產蛋雞的飲食中，有效改善蛋形指數、哈夫單位值（Haugh unit）和蛋黃顏色，減少蛋黃膽固醇含量［8］。小鼠灌胃實驗證明，膠紅酵母ZTHY2對小鼠免疫功能有增強作用［3］。在羅非魚日糧中添加海洋源膠紅酵母CYJ03，能有效提高羅非魚的生長性能、提高血清和肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）和抗氧化酶活性［9］。以上研究表明，紅酵母可作為養殖飼料的添加劑，促進動物的生長發育，助力養殖經濟的發展。

此外，紅酵母在食品、醫藥、化妝品、環境治理等方面也有廣泛應用。野生膠紅酵母糖苷酶對制造媚麗葡萄酒具有良好的增香釀造應用潛力［10］。將膠紅酵母和釀酒酵母依次接種，有助于降低發酵速率，增加膠紅酵母生長時間，提升糖苷酶的活性［11］。紅酵母紅素（torularhodin）和多糖對急性肝損傷存在干預作用，為開發功能保健品提供了科學依據和理論支持［12］。酵母產的紅色素還能抑制細胞中活性氧的積累，減少轉基因果蠅腦中淀粉樣乙型蛋白水平和神經變性的面積，在治療神經退行性疾病方面具有較大潛力［13］。海洋真菌小紅酵母（R.minuta）MNP100101A具有抗腫瘤活性，對腫瘤細胞HepG2（肝癌細胞）、PC-12（神經癌細胞）均具有一定細胞毒性，為新藥篩選提供基礎［14］。

酵母發酵物因含有豐富的活性成分被廣泛應用于化妝品中，主要功效有美白、保濕、抗衰老、調理皮膚酸堿度并修復受損皮膚等。近年來，許多化妝品都使用了微生物發酵技術，其添加成分大致分為酵母提取物、酵母溶胞產物提取物、酵母發酵產物提取物和酵母發酵產物溶胞濾液4類，如海洋紅酵母面膜以海洋紅酵母提取液為主要成分，具有良好的抗衰老、修護、美白保濕功效［15］；抗衰老眼霜中含有富番茄紅素酵母提取物，具有提升皮膚含水量和彈性、降低經皮水分丟失、減少皺紋、改善皮膚暗黃的長效護膚作用［16］。

在環境治理方面，黏紅酵母ARTP-17菌株能利用工業廢水為底物進行油脂的生產，在處理廢水的同時，還能降低微生物油脂生產的成本，因此在環境生物修復和生物煉制等領域具有重要意義［17］。

1.2 紅酵母的活性物質

紅酵母富含蛋白質、多糖等常規營養成分，可以生產類胡蘿卜素、番茄紅素、多不飽和脂肪酸、維生素E和核苷酸等生物活性物質［18］，這些活性物質在不同領域有廣泛的應用價值。

1.2.1 多肽和酶 酵母中含有豐富的多肽，其氨基酸組成合理，生產條件易于控制，且具有多種活性，如抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧化等，在食品、醫藥、化妝品等領域都有廣泛的應用。

從冰川中分離得到的紅酵母（Rhodotorula）菌株至少產兩種胞外酶，其中少部分產5種酶（纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、脲酶蛋白酶、脂肪酶），絕大部分產纖維素酶和果膠酶，產蛋白酶和脂肪酶的菌株相對較少［19］。從土壤、奶制品、水果中篩選獲得了3株高氨氮利用的酵母菌，分別是膠紅酵母（R.mucilaginosa）SXAU-002、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SXAU-001和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）SXAU-003。比較3株酵母菌的谷氨酸脫氫酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶活性發現，釀酒酵母的酶活性最高，其次是膠紅酵母。這兩種優良菌株產生的酶應用在飼料中，可滿足水產動物對營養物質的需求，是酵母類單細胞蛋白飼料發酵的優良菌株［20］。從膠紅酵母中分離并純化的醛縮酶，也可作為降解次生有毒代謝物棒曲霉素（patulin）的材料，為工業應用提供了理論基礎［21］。在膠紅酵母BEI29的胞外酶液中檢測到了β-D-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-木糖苷酶和酯酶，這些酶的添加能顯著提升葡萄酒的香氣質量，使所釀酒具有較好的果香和花香［22］。紅酵母這種產胞外酶的特性可被廣泛用于食品、化妝品、制藥等領域中，具有廣闊的應用前景。

1.2.2 多糖 采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法進行研究發現，膠紅酵母胞外多糖組分（R.mucilaginosaexo-polysaccharide 2-A, REPS2-A）能有效抑制肝癌細胞HepG2的增殖，使肝癌細胞HepG2阻滯發生在G1/S期［23］。對R.mucilaginosaCM-1進行無機培養基分離，純化得到了均一、純度高的酵母胞外多糖組分 RmEPS-11［24］。進一步評估RmEPS-11對小鼠異煙肼（INH）和利福平（RIF）引起的肝臟毒性的影響，并對其作用機制進行研究。結果顯示，與異煙肼和利福平處理的小鼠相比，RmEPS-11給藥后各項指標均有所好轉，證明多糖RmEPS-11對小鼠急性肝損傷有一定的保護作用［25］。這些結果表明，膠紅酵母胞外多糖具有成為治療肝癌或作為抗腫瘤藥物的潛力，但對其抑制癌癥的機制、毒性及產糖相關的基因方面仍不清楚，有待深入研究。

1.2.3 類胡蘿卜素 類胡蘿卜素是植物進行光合作用的重要色素，其中最有價值的是蝦青素，是一類酮式類胡蘿卜素，具有極強的抗氧化能力，可由多種紅酵母來生產。多篇文獻都報道了紅酵母能合成蝦青素，如擔子菌酵母（basidiomycete yeast）中的紅發夫酵母（Phaffia rhodozyma）［26］及其遠緣菌種Xanthophyllomyces dendrorhous［27-28］。Dioszegiasp［29］還有紅酵母屬（Rhodotorula），擲孢酵母屬（Sporobolomyces）和鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）的少數物種也是類胡蘿卜素的生產者［28］。

類胡蘿卜素可通過非特異性反應或類胡蘿卜素裂解加氧酶作用裂解產生去甲腎上腺素，從而產生花香、果香和甜香，改變食品風味［30］，在食品、藥品、化妝品方面有多種應用。

此外，類胡蘿卜素作為天然食品著色劑，因其易獲得性、非季節性、可擴展性和產量高而成為合成化合物的有效替代品［31］。1997年起，浙江工業大學、華南理工大學以及農業農村部（原農業部）飼料中心等科研單位對紅發夫酵母高產蝦青素突變株篩選和發酵代謝調控、蝦青素的提取方法等方面進行了深入研究［18］。近幾年，許多研究試圖通過優化培養條件來提高幾種膠紅酵母產類胡蘿卜素的產量。通過優化膠紅酵母 ZTHY2 發酵培養基成分和培養條件明顯提升了類胡蘿卜素產量［3］，對航天誘變膠紅酵母突變株JH-R23膠紅酵母突變株合成蝦青素的培養基進行優化，并對其生長特性進行探究［32］,將膠紅酵母AJB01置于各種壓力條件下，包括不同鹽的滲透壓力、紫外線的物理壓力和使用不同光周期的光照壓力，最終探究出產類胡蘿卜素的最佳條件［33］。

以上研究工作為類胡蘿卜素的工業化生產提供了條件和基礎，未來有望實現更低成本的大規模生產。值得注意的是，天然色素也存在一定的問題，如對紅酵母發酵時氣味的去除、無毒和無致病性菌株的使用、環境中的穩定性和保質期問題，隨著對紅酵母的認識和代謝工程改造的發展，以上問題也將得到更好解決。

紅酵母還能產生其他副產品，如油性酵母R.pacificaINDKK可通過利用未解毒的制糖工業廢料生產生物柴油及其他具有商業價值的副產品（脂質、β-胡蘿卜素和動物飼料），從甘蔗渣廢棄的半纖維素部分生產木寡糖（XOS）可以進一步減少生物柴油的生產成本［34］。表1列出了紅酵母的主要活性成分和用途。

表1 紅酵母的活性成分及用途Table 1 Active ingredients and uses of red yeast

1.3 紅酵母的基因組研究

隨著研究手段不斷進步，對紅酵母基因組的研究變得更加深入和完善，目前，已完成了多種紅酵母的基因組測序，主要包括膠紅酵母（R.mucilaginosa）、圓紅酵母（R.toruloides）和克氏紅酵母（R.kratochvilovae）等種，其基因組大小及注釋相關信息如表2所示。

表2 紅酵母屬部分種基因組裝和注釋數據Table 2 Gene assembly and annotation data for selected species of the genus Rhodotorula

由表2可得，膠紅酵母（R.mucilaginosa）是研究最多的種，其次是圓紅酵母（R.toruloides）和克氏紅酵母（R.kratochvilovae），其他菌種也有少部分有測序，但大部分測序水平都集中在contig和scaffold水平，未完成scaffold在染色體上的定位，因此沒有完整全基因組序列。

對具有基因組信息的膠紅酵母的101個菌株來源進行分析，結果見圖1。絕大部分（91%）都來自于國際空間站（ISS），包括環境表面、餐桌、永久多用途艙、乘員補給車、廢物和衛生隔間及零重力儲存架等，還有少部分是從土壤（3%）、濕地（1%）、海洋（1%）、種子（1%）、Kefir（開菲爾）（1%）、血液（1%）和農貿市場（1%）中分離得到的。國際空間站來源的膠紅酵母測序占主導，其原因是個別膠紅酵母菌株被歸為病原菌株，可在中心靜脈血管上聚居，形成生物膜而引起真菌血癥［51］。國際空間站微重力和輻射等極端條件能增強抗菌性和生物膜形成，對膠紅酵母進行基因組測序為進一步研究消除這種威脅提供了基礎。因此，基因組研究提示在紅酵母應用中需要注意可能的病原菌的風險，進行合理的安全評價。

圖1 有基因組序列的膠紅酵母來源分析Fig.1 Analysis of the origin of R.mucilaginosa strains with sequenced genome information

通過對紅酵母的基因組進行分析，發現了多個生物合成基因簇。例如，對膠紅酵母CYJ03的基因組進行掃描時，發現了負責類胡蘿卜素的生物合成基因簇［45］，RIT389種中發現了生產類胡蘿卜素關鍵基因的基因組區域［52］，50-3-19/20B中發現了合成萜類化合物、非核糖體多肽合酶（NRPS）和脂肪酸的基因簇并鑒定了一種外源性胰島素酶的基因位點（g1629.t1）［53］。對JGTA-S1進行測序、組裝和注釋發現，其擁有幾個有利于內生生存的基因，如溶解磷酸鹽和生產植物激素的基因。此外，還具有功能性抗凍基因g5846.t1和g5876.t1，在氮代謝方面十分獨特，其硝酸鹽同化途徑被截斷，可能導致與重氮內生菌的聯系和維持，使得對其與植物的有益互作有了更深入了解［54］。這些基因組的研究為紅酵母代謝和生物合成研究提供了基因組學見解。

新一代DNA測序技術的發展推動了高通量轉錄組測序（RNA-seq）及基因表達譜分析的成熟，動態的轉錄組比靜態的基因組更加復雜，因而能對紅酵母的遺傳信息有更深入了解。對R.toruloidesNP 11進行基因組和轉錄組測序，結果表明，在氮限制條件下脂質積累與脂肪生成、含氮化合物回收、大分子代謝和自噬的誘導有關，這為設計脂質生產途徑提供了寶貴資源［55］。此外，通過對NP11線粒體基因組進行重組和注釋，并與其他菌種進行比較，表明交配類型互補品系的線粒體基因組之間存在明顯的遺傳差異，也補充了對圓紅酵母遺傳背景的理解，未來有望開啟編輯線粒體基因組的大門，進行更合理的代謝工程和表型設計［56］。

利用YEASTRACT+門戶網站及其數據設計了分析酵母基因組的序列工具，在預測圓紅酵母轉錄因子RtHaa1對乙酸脅迫反應方面有應用，為在基因組尺度上預測發生在圓紅酵母中的調節相互作用鋪平了道路，有助于選擇和設計出用于木質纖維素生物煉制的更強大菌株［57］。

在蛋白質組學方面，通過將不同蛋白質組學工作流程應用于膠紅酵母以評估產蛋白質和功能信息方面的潛力，產生了大量關于膠紅酵母代謝的信息［58］。根據生物化學分析和RNA測序，研究了糖酵解、三羧酸循環和氧化磷酸化3種關鍵途徑，發現在Pb脅迫下R.mucilaginosa顯示出對廣泛的Pb2+濃度的耐受性，并根據轉錄組分析確定了參與碳水化合物和生物能量代謝的幾個關鍵基因，這些基因對Pb2+壓力有反應，揭示了紅酵母關鍵代謝途徑和重金屬脅迫在RNA水平上的相關性［59］。

2 紅酵母的遺傳改造研究進展

為了更好利用紅酵母生產所感興趣的活性代謝物，需結合菌株的遺傳改造和培養基及培養條件的優化。研究者對紅酵母的代謝工程改造進行深入研究，確定了影響目標代謝的關鍵基因位點，再對菌株進行遺傳改造，構建出更具有生產優勢的紅酵母菌種。紅酵母代謝工程改造的技術路線，以及對關鍵的遺傳改造方法見圖2。

圖2 紅酵母的研究改造Fig.2 Research and modification of red yeast

2.1 紅酵母的遺傳轉化系統

酵母菌株的遺傳轉化方法主要包括農桿菌介導的轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）、電轉化和化學轉化等。ATMT是目前在圓紅冬孢酵母遺傳改造比較常用的轉化方法，對該方法進行優化，研究者發現了和圓紅冬孢酵母色素合成相關的關鍵基因［60］。在另一項研究中，研究者利用序列條形碼農桿菌T-DNA插入圓紅冬孢酵母基因組獲得突變體文庫，發現了1 337個低T-DNA插入率的可能的必須基因。進一步分析研究突變體的遺傳組成，利用基因敲除證明35個基因和脂肪酸分解和油脂積累有關，鑒定了高可信度的數據集，包含150個影響油脂積累的基因，包括和信號途徑、蛋白修飾和自噬等相關的基因，以及未知功能的基因，證明了條形碼突變（barcoded mutagenesis）對真菌功能基因組的影響［61］。紅酵母的電轉化和化學轉化方法也獲得了成功，例如我國學者建立了簡單高效的R.toruloides電轉化方法［62］，利用原生質體轉化也實現了R.glutinis的菌株改造［63］。值得注意的是，不同菌株其合適的遺傳轉化方法也可能不同，因此需要針對特定菌株進行優化。

2.2 紅酵母基因編輯工具開發

基于CRISPR/Cas9的基因組編輯系統目前已經廣泛用于多種酵母的菌株改造，有助于加速高效酵母細胞工廠的開發［64］。基于CRISPR-Cas9基因編輯主要針對圓紅冬孢酵母R.toruloides展開，膠紅酵母和黏紅酵母等其他紅酵母的相關研究較少，未來有待開發多種紅酵母的高效基因組編輯工具。

啟動子優化對基因編輯系統效率較為重要。研究證明，在CRISPR/Cas9系統用融合5S rRNA-tRNA的啟動子表達引導RNA（gRNA）能夠對R.toruloides基因進行高效敲除，利用這種方法還進行了雙基因的高效敲除［65］。通過整合在GAP啟動子下表達Cas9和在S.cerevisiaeSNR52啟動子下表達gRNA的盒，使用基于CRISPR-Cas9的基因阻斷成功對R.toruloides內源URA3基因進行了定向破壞，并應用優化的設計條件破壞了另一個參與類胡蘿卜素生物合成的內源基因CAR2，最后在一次轉化中實現同時破壞CAR2和URA3基因［66］。

另一個較成功的例子將含有密碼子優化的Cas9基因的表達盒整合到R.toruloides基因組中，產生了具有足夠產量的金黃色葡萄球菌來源的Cas9蛋白的菌株。同時，確定了兩個U6基因，預測了兩個U6啟動子，并確認用U6b啟動子更好地轉錄單向導物RNA（sgRNA）。接著設計了針對CRT1、CAR2和CLYBL基因的sgRNA盒，轉化到Cas9表達的菌株中，發現超過60%的轉化子成功發生了插入和刪除突變［67］。

和模式酵母釀酒酵母相比，紅酵母和其他非常規酵母的遺傳轉化效率還有待進一步提高，未來隨著高效轉化系統的建立，紅酵母菌株的代謝工程改造效率也將大幅度提高。

3 紅酵母的代謝工程研究

紅酵母在最近的綜述中都作為一種比較有價值的非常規酵母被討論，具有許多工業生產相關的生理代謝優勢和特性，吸引研究人員通過各種代謝工程策略從底物利用、前體供應、合成途徑等多方面來提高其代謝性能［68-69］，將其改造成為高效生產各種化學產品的細胞工廠。下面對近5年關鍵的紅酵母代謝工程進展進行了總結。

3.1 利用紅酵母的代謝工程改造生產天然產物和中間體

近年來利用多種非常規酵母生產植物來源天然產物及其他異源產物引起了國內外研究者的關注，以下為代表性的案例。

三乙酸內酯（triacetic acid lactone, TAL）可用于生產多種具有商業價值的化學中間體，如間苯三酚、乙酰丙酮和山梨酸。研究者將密碼子優化過的來自非洲菊的2-吡喃酮合酶基因引入圓紅冬孢酵母中，并過表達可能的限制性前體物質乙酰輔酶A相關的酶ACL1和ACC1，所獲得的重組菌株通過補充醋酸鹽的葡萄糖或甘蔗汁為底物進行發酵，TAL產量達到28 g/L和23 g/L，體積生產強度顯著高于前期報道的利用解脂耶氏酵母的水平，這項研究也為利用圓紅冬孢酵母生產聚酮或其他乙酰輔酶A的衍生物提供了參考［70］。

白藜蘆醇（resveratrol）是來源于植物的具有多種生物活性的天然多酚類物質，廣泛應用在食品、醫藥和化妝品等領域。研究者利用來自于擬南芥和美洲葡萄等植物的外源基因整合、外源和內源P450酶融合，以及改善輔酶供應等不同手段，首次實現了利用圓紅冬孢酵母生產白藜蘆醇［71］。

檸檬烯（limonene）為廣泛應用于食品、藥物以及先進生物燃料的單萜類化合物，由于紅酵母可以利用木糖等多種碳源，且可天然產生多萜類物質類胡蘿卜素，提示該酵母具有比較強的天然甲羥戊酸（mevalonate, MVA）途徑碳流，因此推測紅酵母具有比較好的潛力生產萜類化合物。通過對外源基因和內源基因的改造，研究者成功構建出類胡蘿卜素生成缺陷的R.toruloides生產檸檬烯［72］，后續可通過進一步強化前體供應提高產量。

由于類胡蘿卜素和油脂等產物共用乙酰輔酶A和MVA途徑，因此推測破壞類胡蘿卜素合成有利于生產其他相關產物。篩選T-DNA隨機插入失活的R.mucilaginosaC2.5t1突變體發現，突變體W4在八氫番茄紅素去飽和酶基因CAR1內部存在插入失活，該突變體輔酶Q10和 甾醇等產量明顯提高［73］，提示可通過降低競爭途徑的基因表達提高目標產物的產量。

以上研究不僅為利用紅酵母生產多種異源天然活性產物提供了成功的范例，也為進一步開發利用紅酵母細胞工廠進行動植物來源活性物質的可持續生產提供借鑒。

3.2 改造紅酵母促進油脂及脂肪酸衍生物生產

多種紅酵母是較好的微生物油脂生產菌，但是天然菌株油脂生產的效率還有待提高，因此有必要通過代謝工程改造，進一步提高油脂及脂肪酸衍生物的產量。

在圓紅冬孢酵母IFO0880菌株中，通過基因缺失和過表達使脂酰-CoA還原酶的脂肪醇濃度明顯提高，其中酰基轉移酶LRO1的刪除增加了脂質和脂肪醇的生產，為研究脂質代謝創造了可能的途徑［74］。在NaOH催化下，R.toruloides細胞中的脂質可直接轉化為脂肪酸甲酯（FAMEs），這種方法簡單便捷，且具有更高的生物柴油轉化率［75］。通過引入不同來源的蠟酯合酶基因，構建了R.toruloides的脂肪酸乙酯（FAEE）生物合成途徑，并表達了來自不動桿菌（Acinetobacter baylyi）的雙功能蠟酯合酶/酰基-CoA-二酰甘油轉移酶（WS/DGAT）基因，培養生產了826 mg/L的FAEE，進一步對雙功能酶進行突變，消除DGAT活性，將濃度提高到了1.02 g/L［76］。最終通過將菌株Δku70-AbWS*在反應器進行批式和補料培養，最高達到9.97 g/L FAEEs產量，而且絕大部分產物分泌到胞外，可顯著降低下游處理破碎細胞的成本。在R.toruloides菌株中操縱4個與三酰甘油（DAG）和二酰甘油（TAG）間相互轉化有關的基因，以促進DAG和游離脂肪酸（FFA）的產生。其中，3個與TAG合成相關的基因DGA1、LRO1和AREA1通過RNA干擾技術被連續下調，一個由TGL5編碼的內源性TAG脂肪酶與LDP1融合并過度表達，將TAG轉化為DAG和FFA。當在氮限制的培養基中培養時，DAG和FFA的含量分別提高了2倍和3倍［77］。另外，還有研究采用過表達乙酰輔酶A羧化酶（ACC1羧化酶）基因和抑制3-羥基3-甲基戊二酰還原酶（HMG-CoA還原酶）的雙重策略來提高R.mucilaginosa的脂質生產［78］。

3.3 利用紅酵母代謝工程改造促進類胡蘿卜素生產

利用紅酵母生產類胡蘿卜素長久以來一直受到研究者的關注。隨著紅酵母的遺傳改造系統不斷成熟，利用重組菌株高效生產類胡蘿卜素的研究也不斷被報道。

改善類胡蘿卜素合成的代謝工程，可通過過量表達內源生物合成途徑中的基因、刪除競爭途徑中的基因，及異源表達外來基因超量生產目標化合物來實現。例如，通過使用強啟動子和終止子過量表達來自X.dendrorhous的CRTE、CRTYB和CRTII，將代謝流更多導向β-胡蘿卜素，結合培養基優化，工程菌株R.glutinisP4-10-9-63Y-14B產生27.13 mg/g細胞干重的β-胡蘿卜素，比野生型菌株提高了129倍［63］。此外，研究通過篩選、組合不同來源的催化元件，調節模塊表達水平等手段，提高了類胡蘿卜素合成通量、降低了代謝中間體積累，達到構建類胡蘿卜素合成細胞工廠的目的［79］。代謝工程改造策略也可以與隨機誘變結合，得到高產類胡蘿卜素的紅酵母菌株［65］。

由于不同種酵母存在差異，在進行改造時也需要將一些環境適應性問題考慮在內，如逆境壓力適應機制、潛在的代謝能力和靈活性等［80］，得到更好的效果。

總之，通過對紅酵母進行代謝工程改造能得到高產的菌株，其產生的代謝物不僅綠色環保，還具有巨大的經濟價值，是生物燃料和其他高值商品的替代來源，在未來具有廣闊的應用前景。表3為紅酵母代謝工程改造的成功案例。

表3 對紅酵母代謝工程改造總結Table 3 Summary of metabolic engineering modification of red yeast

4 存在的問題及未來發展趨勢

紅酵母的研究已引起了學術界和工業界的興趣，生理學研究揭示了其具有優良特性，如高細胞密度和代謝不同碳源、氮源的能力，可利用這些特性轉化低成本的原料生產高價值的代謝產物，如油脂、類胡蘿卜素、酶等［82］。目前紅酵母相關研究存在的問題如下。

首先，紅酵母最大的問題在于精準編輯（包括精準基因整合和無痕敲除）的效率比較低。最新的報道中研究人員開發了新的基于CRISPR的基因編輯平臺，命名為Lowered Indel Nuclease system Enabling Accurate Repair（LINEAR），實現了畢赤酵母、解脂耶氏酵母、馬克斯克魯維酵母和多型漢遜酵母等不同非常規酵母的高效改造。與傳統的方法相比，該系統可以實現高達67%-100%的同源重組效率［83］。我國學者在畢赤酵母中強化了同源重組效率發現，高表達同源重組相關的關鍵基因RAD52和敲除MPH1可有效提升同源重組效率［84］。另一工作構建和優化了基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術，通過優化Cas9蛋白和sgRNA，動態調控非同源末端連接關鍵基因KU80和增強表達同源重組修復蛋白等手段，有效提高同源重組效率，依托該系統成功在多形漢遜酵母（O.polymorpha）中實現基因無痕敲除、大片段整合以及多片段重組［85］。以上技術未來也有望在紅酵母中得到應用，提高紅酵母精準基因編輯的效率。

其次，與其他非常規酵母相比，紅酵母的基因組水平的研究還相對較少，很多基因的功能未知，缺乏關于代謝網絡相互作用和代謝平衡調控與應答等基礎信息。此外，基于關鍵酶進行定向進化及理性設計以提高關鍵酶催化活性的策略應用也較少，這阻礙了紅酵母關鍵途徑催化效率的最大化提升。未來在建立高效紅酵母基因組編輯技術的基礎上，相關的代謝途徑和分子調控機制也將快速深入，有希望能進一步提高利用紅酵母生產多種活性物質的效率。

最后，在紅酵母的工業應用方面還受到成本問題的限制，要實現大規模生產需考慮工藝優化和放大策略，整合和加強上、下游工藝，構建多功能的微生物細胞工廠，提高產量和效率。此外，利用廉價的來源豐富的可再生生物質資源，包括木質纖維素類生物質和廚余廢棄物等，可實現變廢為寶和可持續生產。但是，這些天然底物可能存在毒性的抑制物，比如酚類抑制物等，可通過研究紅酵母對這些抑制物的耐受性和生物轉化，提高其實際應用的效率［86］。

隨著下一代測序技術的發展、基因組編輯工具的完善和全系統組學研究的發展，國內外研究者對非常規酵母獨特代謝和生理特征的理解逐步加深［87］，紅酵母的相關研究也在不斷完善。未來預計相關研究的不斷深入，將更有助于在生理學和生物學方面對紅酵母的理解，從而更好地利用紅酵母資源，提高生物煉制效率。