TRV病毒誘導大豆基因沉默體系優化及應用

李文辰 劉鑫 康越 李偉 齊澤錚 于璐 王芳

（1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，齊齊哈爾 161005）

基因沉默是植物界普遍存在的一種防御反應，其本質是降低或停止植物基因的表達，根據基因轉錄前后可分為兩種，一是轉錄前由于啟動子失活或基因片段特異性甲基化產生的基因沉默（transcriptional gene silence，TGS），二是轉錄后mRNA被降解導致的基因沉默（post-transcriptional gene silence，PTGS）［1］。病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是一種準確高效的RNA沉默方法，屬于PTGS類型的RNAi技術，可以在多種植物中精準沉默植物內源基因且在數周內完成對基因的沉默，不需要轉基因植株［2］，廣泛應用在植物基因功能研究。該技術利用病毒載體將待沉默的RNA轉移至寄主植物中，病毒雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）被植物的防御機制所識別，并被植物體內特異性核酸內切酶切割成21-23 nt小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），觸發PTGS反應，siRNA與Agronaute（AGO）效應復合物形成RNA誘導復合物（RNA-inducing silencing complex，RISC），RISC與植物中mRNA和病毒中的mRNA結合產生沉默，其特點在于依靠植物防御機制，抵御病毒侵染的同時完成基因沉默［3］。

目前，已開發出超過30個病毒載體被用于VIGS體系構建，如煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus, TMV）、大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus, BSMV）、大豆花葉病毒（soybean mosaic virus, SMV）等［4］，廣泛應用在茄科、十字花科、禾本科等植物的基因功能研究［5］。

利用VIGS技術探索大豆基因功能已成為克服大豆基因轉化困難的一種有效研究手段。以豌豆早期褐變病毒（pea early-browning virus, PEBV）、普通花葉病毒（soybean yellow common mosaic virus,SYCMV）、菜豆斑駁病毒（bean pod mottle virus,BPMV）、蘋果潛伏球形病毒（apple latent spherical virus, ALSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus, CMV）為基礎構建的沉默載體已被報道用于沉默大豆基因［6-10］。

煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）是目前在VIGS系統中應用最廣泛的病毒載體，該病毒對植物的毒害作用較輕，避免了對基因沉默表型影響［11］。TRV由2條單鏈RNA組成，RNA1編碼RNA聚合酶及運動蛋白，RNA2編碼病毒外殼蛋白和介導線蟲傳播蛋白，并接受外源基因插入［12-13］。TRV寄主范圍廣泛，除侵染煙草外，還可以侵染大部分雙子葉植物如番茄、擬南芥、核桃、棉花、穿心蓮、紫羅蘭［14-18］等，以及部分單子葉植物如小麥、玉米［19］。TRV介導的VIGS體系在大豆中報道較少。劉曉彬等［20］研究了TRV-VISG技術與大豆花葉病毒（soybean mosaic virus, SMV）的關系，證明大豆早期接種TRV不影響大豆對SMV的抗性。諸多研究結果表明，TRV能夠在不同組織如葉、花、果實、種子［21-24］使靶基因沉默，但關于介導植物根部靶基因沉默的報道較少。病毒存在宿主范圍，大多數VIGS病毒載體不能侵染植物的生長點與分生組織。環境溫度，載體接種部位、方法對靶基因的沉默效率均有較大影響。有的病毒載體會對宿主植物產生嚴重的病毒癥狀，導致葉片萎黃、變形、壞死等現象，從而掩蓋了基因沉默的表型。因此針對不同的植物，選擇合適的病毒載體與接種方法極為重要［2］。

本研究以八氫番茄紅素去飽和酶基因（GmPDS）及前期cDNA文庫中篩選到的差異表達E3泛素連接酶基因（GmATL）為對象［25］，采用葉片注射、澆灌根部、葉片注射與澆灌相結合3種接種方法，建立TRV誘導基因沉默體系，評估不同接種方法、接種部位、靶基因沉默區域對植物不同組織之間的沉默效率，為今后大豆基因功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆品種選用中黃13（Glycine max_ZH13），由沈陽農業大學北方線蟲研究所贈送。

根癌農桿菌GV3101（pSoup-p19）感受態細胞（Cat No.ZC1407）、大腸桿菌Stbl3感受態細胞（Cat No.ZC108）、沉默表達載體pTRV1（Code No.ZK912）、pTRV2（Code No.ZK914）載體購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物種植及培養 選取飽滿中黃13大豆種子，先后使用70%酒精、0.5% NaClO溶液分別消毒3 min，無菌水沖洗10 min，直至種子表面無NaClO殘留。將蛭石與營養土按照1∶1混勻并滅菌，種子置于塑料盆（直徑9.5 cm，高12 cm）培養，光周期16 h L/8 h D，25℃恒溫育苗，每盆播種3粒種子，出苗后每一盆保留幼苗一株。

1.2.2 引物設計 根據NCBI數據庫大豆GmPDS（Gene ID：18G003900）、GmATL3（Gene ID：10079 7420）、內參基因EF4（Elongation Factor 1-alpha，Gene ID：110008577）序列，使用SnapGene軟件設計試驗引物（表1）。GmATL3的沉默區域設計2組引物，GmATL3-1沉默區域含有ATL基因家族RING-H2保守結構域，GmATL3-2沉默區域不包含該結構域（圖1）。

圖1 GmATL3與GmPDS序列及沉默片段區域Fig.1 GmATL3 and GmPDS gene sequences and silent fragment regions

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 TRV沉默表達載體的構建 提取中黃13新鮮根部組織RNA，并反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為cDNA 2 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、高保真酶25 μL和ddH2O 19 μL；反應條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 50 s，34個循環；72℃ 10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗證后回收并純化，測定濃度后，與pTRV2載體連接，并轉入Stbl3大腸桿菌中，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基上，篩選陽性克隆進行菌落PCR鑒定，提取質粒并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果均為100%。將重組質粒pTRV2-GmATL3-1、pTRV2-GmATL3-2和pTRV2-GmPDS轉入農桿菌GV3101中，涂布于含50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平LB固體培養基上，挑取單克隆菌落，菌液PCR驗證，-80℃保存菌種。

1.2.4 農桿菌侵染液制備及接種 配置1% Silwet-77母液以及MES侵染緩沖液（10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2·6H2O），4℃冷藏。待大豆出苗后3 d，將保存的pTRV1、pTRV2、pTRV2-GmPDS、pTRV2-GmATL3-1和pTRV2-GmATL3-2農桿菌菌液劃線于含50 μg/mL卡那霉素與50 μg/mL利福平LB固體培養基，28℃倒置培養48 h，挑取單克隆菌于液體LB培養基，過夜培養，將菌液轉入50 mL離心管中，培養至OD=0.5-0.6，4 000 r/min離心10 min，使用MES緩沖液懸浮菌體，再次離心，去除上清液，加

2 結果

2.1 中黃13 GmATL3與GmPDS的克隆

以中黃13 cDNA為模板，使用GmATL3-1/GmATL3-1-R、GmATL3-2-F/GmATL3-2-R、GmPDSF/GmPDS-R引物進行擴增，分別獲得374、296和218 bp靶基因片段（圖2）。

圖2 GmATL3-1、GmATL3-2、GmPDS PCR凝膠電泳檢測Fig.2 GmATL3-1, GmATL3-2 and GmPDS PCR electrophoresis detection

入MES緩沖液測定OD=0.5-0.6，將pTRV1與重組質粒的MES侵染液等比混合，每毫升侵染液加入1 μL AS母液與0.1 μL Silwet-77母液，室溫暗處靜置3 h，該過程需要4 d。此時大豆的真葉完全展開，按照3種方法進行接種，第一種方法葉部注射，使用滅菌針頭吸取侵染液于大豆真葉背部葉脈處注射侵染；第二種為灌根法，使用滅菌槍頭吸取5 mL侵染液插入土壤中，貼近根部澆灌侵染［26］；第三種為注射加灌根同時侵染接種。每隔7 d接種一次，每種方法共接種3次。

1.2.5 大豆全植株基因沉默效果檢測 侵染后28 d，提取3種處理大豆的第四輪復葉以及根部RNA，反轉錄cDNA，將第四輪復葉及根部cDNA作為模板，熒光定量PCR檢測GmATL3與GmPDS表達量，反應體系為上下游引物各0.8 μL、cDNA 1 μL、2×TB Green Premix Ex Taq II（TaKaRa）10 μL、ROX Reference Dye（50x）0.4 μL、ddH2O 7 μL。RT-qPCR程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環，根據Ct值，采用2-ΔΔCt法計算實時熒光定量RT-qPCR基因相對表達量［27］，以EF-4為內參基因，3次生物學重復和3技術性重復。

2.2 GmPDS基因沉默表型觀察

接種28 d后，分別取TRV-GmPDS基因沉默體系的第二、三、四輪復葉觀察沉默植株葉片表現癥狀（圖3）。與對照CK（pTRV1-pTRV2空載農桿菌混合液的植株）相比，注射接種葉片出現了由葉邊緣到葉內的黃化褪綠現象，灌根接種與注射加灌根接種的葉片表現褪綠黃化以及褶皺褪綠現象。灌根與注射加灌根接種方法的沉默表型更明顯。

圖3 不同接種方法GmPDS沉默葉部表型觀察Fig.3 Phenotypic observations of the leaves after GmPDS silenced via different inoculation methods

分別提取注射接種、灌根接種、注射加灌根接種方法中沉默GmATL3-1、GmATL3-2、GmPDS植株的第四輪葉片與根部RNA，反轉錄為cDNA，使用qATL3-F/qATL3-R、qPDS-F/qPDS-R引物以及內參基因EF-4引物進行RT-qPCR，根據2-ΔΔCt計算出基因相對表達量。

注射接種，根部GmATL3-1、GmATL3-2相對表達量為35.5%和57.9%，葉部GmATL3-1、GmATL3-2相對表達量為4.1%和19.8%，表明注射接種方法在葉部沉默效率較根部高出25%-30%（圖4-A）。

圖4 3種接種方法GmATL3-1、GmATL3-2、GmPDS在根與葉中的相對表達量Fig.4 Relative expressions of GmATL3-1, GmATL3-2 and GmPDS in the roots and leaves by three inoculation methods

灌根接種，根部GmATL3-1、GmATL3-2相對表達量為35.6%和66.7%，在葉部測定GmATL3-1、GmATL3-2基因相對表達量為50.8%和81.1%，表明灌根接種方法在根部基因沉默的效率較葉部高出15%-20%（圖4-B）。

注射加灌根接種，根部GmATL3-1、GmATL3-2相對表達量為10.8%和29.2%，葉部GmATL3-1、GmATL3-2相對表達量為70.9%和85.7%，表明注射加灌根接種方法在根部基因沉默的效率較葉部高出50%-60%（圖4-C）。

在RT-qPCR結果中，3種接種方法GmPDS的CT值均為0，表明基因在葉片與根部沉默效果均接近100%，使用半定量RT-PCR檢測GmPDS沉默情況（圖4-D）。對照組均有條帶，而處理組（3種接種方法）均無條帶，進一步表明3種接種方法中GmPDS被完全沉默。

綜上所述，在注射接種、灌根接種、注射加灌根接種中，無論在葉部還是在根部，沉默包含保守結構域GmATL3-1的沉默效果均比沉默不包含保守結構域的GmATL3-2效果好。

3 討論

3.1 TRV介導的大豆PDS沉默表型分析

八氫番茄紅素去飽和基因（PDS）作為VIGS沉默的指示基因在植物中被廣泛使用，將攜帶PDS的病毒載體轉入農桿菌后侵染植物組織，病毒會在侵染部位積累，并逐步向整個植株擴散侵染，沉默PDS植物產生葉片白化褪綠的可視表型。本研究不同接種方法產生的植物沉默表型存在差異，灌根接種與雙重接種葉片出現了褪綠斑點以及褶皺褪綠現象，注射接種出現葉片邊緣黃化現象，并且與葉片注射法相比，灌根方法引起更為嚴重的表型，這與Ryu等［28］的結論相似。所以根據不同的試驗要求需要選擇合適的接種方法，避免出現因為VIGS病毒掩蓋沉默表型的現象。在煙草中，使用TRV-VIGS技術沉默NbPDS，其沉默效果達到100%，沉默植株的葉片出現了白化褪綠的現象［29］。而在本研究沉默GmPDS，發現3種處理下根部與第四輪復葉GmPDS被完全沉默，葉片產生嚴重褪綠黃化的現象，但葉片并未出現白化現象。劉曉彬等［20］使用TRV載體通過葉片注射的方法沉默GmPDS發現，在第二輪、第三輪復葉產生明顯褪綠現象，也未出現白化現象。Constantin等［6］使用PEBV沉默PsPDS，豌豆葉片出現褪綠白化現象。Schachtsiek等［30］使用CLCrVVIGS技術沉默大麻PDS，觀察到葉子出現白化斑點。以上研究結果表明，不同病毒載體介導不同植物PDS沉默產生表型存在差異。

3.2 不同接種方法對大豆不同組織的沉默效果

常用的植物病毒接種方法包括摩擦接種（friction inoculation）、噴霧接種（spray inoculation）、葉片注射接種、真空注射接種、灌根接種等［5］。VIGS技術通常利用根癌農桿菌Ti質粒將病毒載體中靶基因T-DNA整合到宿主植物基因組中，產生內源性基因沉默，常采取注射以及灌根接種方法侵染植物。注射方法是接種在植物的莖部與葉部，但是此方法較難浸潤玉米等植物葉片，且操作步驟繁瑣，耗費大量的人力物力，因此，該方法無法應用田間試驗。灌根接種是利用含有二元載體T-DNA病毒載體的根瘤菌侵染植物根際來完成接種，方法相對方便快捷。

孫天杰等［26］使用TRV-VIGS技術沉默大豆內源基因發現，XTH平均沉默效率為93%，TLP平均沉默效率為44%，確定不同基因的沉默效率存在差異。本研究發現TRV介導的PDS在根部與葉部沉默效率均接近100%，GmATL3最高沉默效率為96%。接種方法影響不同組織的基因沉默效率。注射接種在根部及葉部的平均沉默效率分別為53%和88%；灌根接種方法對根部及葉部的平均沉默效率分別為50%和35%；注射加灌根接種方法對根部及葉部的平均沉默效率為80%和22%。結果表明，注射方法對葉片沉默效率最高，注射加灌根結合方法對根部沉默效率最高。接種位置影響病毒擴散的速率，因此，應根據實驗的目的選擇適宜的接種方法。

3.3 基因沉默片段的選擇

基因沉默效率受到沉默片段的長度及位置影響，因此選擇合適的沉默片段極為重要。VIGS技術通常選用200-400 bp的基因序列作為沉默片段。本研究的3個沉默片段長度為186、264和342 bp，均具有較好的沉默效果。如果選擇的沉默片段與其他基因同源性較高，會導致沉默脫靶現象［31］。為了避免沉默的脫靶效應，本研究將GmATL3分為2條沉默片段，結果表明，二者均能夠沉默靶基因，且發現沉默片段包含保守結構域的基因相對表達量在根部及葉部均低于不包含結構域的相對表達量，沉默效果無論在根部還是葉部比均不包含結構域高出20%左右，含有結構域的基因沉默片段具有較高的沉默效率。Chen等［32］發現沉默牽牛花高度保守基因序列可以沉默該基因家族的多個成員。Zhou等［33］沉默本氏煙E2基因高度同源序列，最終沉默E2基因家族大部分基因，且3 nt錯配的基因片段會提高沉默的效果。選擇基因家族的保守區可能會沉默一個基因家族中的多個基因；如果目標基因是某一基因家族中的單個基因，插入片段應是該基因的特異序列，避免有超過23個核苷酸序列與其他家族成員相同［34］。大豆RING-H2 ATL家族是多基因家族，結構域序列是否會對該家族其他基因產生沉默效果還有待于進一步驗證。

4 結論

建立了大豆TRV-VIGS體系，可實現TRV介導的大豆基因沉默，并產生葉片基因沉默表型。不同接種方法均可產生葉片沉默表型，主要表現褪綠黃化及褶皺。接種方法影響植株不同組織的基因沉默效率，注射方法對葉片沉默效率最高，注射加灌根結合方法對根部沉默效率最高。相同接種方法對根及葉部的基因沉默效率也存在差異。