茶樹CsTMFs的克隆與表達分析

孫明慧 吳瓊 劉丹丹 焦小雨 王文杰

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，合肥230001）

茶是起源于中國的世界三大無酒精飲料之一，由茶樹（Camellia sinensis）葉片加工制備而成，具有抗炎、抗病毒和降血糖等多種生理功能［1］。茶樹易受生物脅迫和非生物脅迫的威脅，影響茶樹產(chǎn)量和質(zhì)量。其中茶樹對冷較為敏感，茶樹喜溫不耐寒，這也是制約茶樹種植區(qū)擴大的重要原因之一［2］。隨著全球氣候變暖，干旱日益嚴重，制約茶葉生產(chǎn)［3］。低溫會破壞細胞、限制植物生長，而干旱脅迫會降低茶葉產(chǎn)量、增加茶樹死亡率，低溫和干旱均會對茶樹的次級代謝和生長發(fā)育帶來不利影響［4］。

TATA元件調(diào)控因子（TATA element modulatory factor，TMF）在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中能特異結(jié)合TATA-box［5］，最早在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在動物中研究較多，主要參與基因的表達調(diào)控、蛋白降解、細胞內(nèi)的膜運輸?shù)龋⒃诰影l(fā)育［6-7］、腫瘤發(fā)生［8］、細胞的代謝應(yīng)激中也發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。水稻中僅有1個與人類同源的TMF基因——OsTMF，雙定位于細胞核及高爾基體，含有TMF-DNA-bd和TMF-TATA-bd 2個保守結(jié)構(gòu)域［10］。冷脅迫處理下，OsTMF表達上調(diào)，水稻細胞壁結(jié)構(gòu)成分果膠、纖維素含量發(fā)生改變，低溫誘導(dǎo)OsTMF直接調(diào)控OsBRUP16、OsCesA4和OsCesA9顯著上調(diào)，表明OsTMF通過調(diào)控水稻細胞壁的合成與降解響應(yīng)低溫脅迫，影響水稻對低溫的敏感性［10］。低溫處理OsTMF-OE植株，脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1家族（dehydration-responsive clement binding protein 1，DREB1s）編碼基因表達上調(diào)，維持ROS水平并促進脯氨酸的積累，揭示DREB1s基因在植物低溫脅迫應(yīng)答中起著正調(diào)控的作用［11-12］。

目前，TMF基因僅在擬南芥［13］、水稻等植物中獲得鑒定，茶樹中暫未報道。本研究通過對茶樹全基因組CsTMF基因進行篩選與鑒定，得到2個CsTMF基因。對這2個CsTMF基因進行克隆和生物信息學(xué)分析；利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與qPCR方法探索低溫和干旱脅迫下CsTMF的表達模式，為茶樹TMF基因的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 茶樹CsTMF基因家族的篩選與鑒定

在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索水稻OsTMF的cDNA序列（登錄號：AK067-197），下載其氨基酸序列，用已鑒定的OsTMF氨基酸序列作為種子序列，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（http://tpdb.shengxin.ren/index.html）上進行BLASTP對茶樹基因組進行序列比對搜索，得到茶樹CsTMF成員氨基酸序列，同時通過在線數(shù)據(jù)庫Interpro（Interprohttps://www.ebi.ac.uk/interpro/）對序列進行結(jié)構(gòu)域分析，以確定其含有TMF-DNA-bd和TMF-TATA-bd完整保守結(jié)構(gòu)域。

1.2 CsTMFs的克隆與測序

使用NCBI Primer-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在線設(shè)計CDS全長引物（表1）。選取安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹品系比較試驗園（以下簡稱品比園）福鼎大白茶成熟葉片進行RNA的提取，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，利用高保真酶 KOD One PCR Master Mix（TOYOBO），進行PCR擴增。反應(yīng)程序為98℃10 s；55℃ 5 s，68℃ 10 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測，回收純化，與pEASY-Blunt Cloning載體（TRANSGENBIOTECH）連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)卡那篩選后，選擇陽性克隆送南京擎科生物科技有限公司測序。

表1 PCR 引物信息Table 1 Primer sequences for PCR

1.3 茶樹CsTMFs家族保守基序與結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用TBtools軟件對測序所得的序列進行開放閱讀框的查找及氨基酸序列的翻譯；使用MEME（Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation）在線分析工具（http://meme.sdsc.edu/meme4_3_0/intro.html）對CsTMFs的蛋白保守基序進行分析，基序的最大數(shù)值設(shè)為10，其余參數(shù)均為默認值，通過在線數(shù)據(jù)庫Pfam對motif進行結(jié)構(gòu)域分析。使用Gene Structure Display Server（http://gsds.gao-lab.org/）繪制CsTMFs家族的基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 茶樹CsTMFs生物信息學(xué)分析

使用在線軟件Prot Param（http://web.expasy.org/ prot param）推導(dǎo)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)；用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）對CsTMF1進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；從基因組數(shù)據(jù)庫中查找CsTMFs家族2個基因的位置信息，使用TBtools軟件對目的基因進行染色體定位分析；通過WoLFPSORTII在線軟件（https://www.genscript.com/tools/wolf-psort）進行亞細胞定位；通過STRING在線軟件（https://string-db.org），以在OsTMF的互作網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)預(yù)測茶樹CsTMF潛在的互作關(guān)系。運用NCBI數(shù)據(jù)庫中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST程序下載多個物種的TMF蛋白序列，使用MEGA 7軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建，Bootstrap檢驗值設(shè)置為1 000；并使用MAFFT version 7（https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/adjustdirection.html）對不同植物的TMF同源蛋白進行序列比對，用在線軟件Sequence Manipulation Suite:（https://groups.molbiosci.northwestern.edu/）進行顏色對齊。

1.5 茶樹CsTMFs的差異表達分析

從公共數(shù)據(jù)庫［14］下載CsTMFs在茶樹芽、花、果實、嫩葉、成熟葉、老葉、根和莖中組織表達情況的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用TBtools軟件繪制熱圖。

低溫脅迫：選取品比園中舒茶早新鮮枝條為材料，進行（4±1）℃低溫脅迫處理，分別于0、3、6、9、12、24、36和48 h摘取3-5個枝條第二葉，作為低溫脅迫的樣品，并設(shè)置對照組于人工氣候室（24±2）℃環(huán)境下同時間點取樣。

干旱處理：將穩(wěn)定生長于人工氣候室（24±2）℃的舒茶早枝條轉(zhuǎn)移至PEG-6000溶液（濃度20%）進行干旱處理，分別于0、1、2、4、8、12、24和48 h摘取3-5個枝條第二葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆茫鳛楦珊得{迫樣品。

使用NCBI Primer-BLAST在線軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計CsTMF1與CsTMF2的熒光定量引物（表1），以茶樹的β-actin（登錄號KJ946252）為內(nèi)參基因。進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為SYBR Green I Master 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL和ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 60 s，95℃ 1 s，采用2-ΔΔCT法［15］進行定量數(shù)據(jù)分析。使用GraphPad prism 7軟件進行作圖，采用IBM SPSS Statistics 21單因素的方差分析對CsTMFs表達水平的差異顯著性進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CsTMF基因家族篩選與鑒定

以水稻OsTMF氨基酸序列為模板，在TPIA進行在線BLASTP比對，根據(jù)比對結(jié)果下載候選蛋白序列。通過Interpro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）對序列進行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（圖1）顯示，有2個氨基酸序列包含TMF-DNA-bd（pfam12329）和TMFTATA-bd（pfam12325）保守結(jié)構(gòu)域，獲得茶樹TMF同源氨基酸兩個CSS0015824和CSS0047293，其中，CSS0015824與CSS0047293的相似度為86.4%。

圖1 CsTMFs蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Domain analysis of CsTMFs proteins

2.2 CsTMFs的克隆與測序

以福鼎大白茶葉樣品的cDNA為模板進行擴增，獲得2個3 000 bp條帶，分別命名為CsTMF1和CsTMF2（圖2）。經(jīng)測序可知，CsTMF1序列全長3 052 bp，與茶樹基因組預(yù)測的CsTMF1（GenBank：CSS0015824.1）序列相似度達99.6%，該序列包含2 934 bp開放閱讀框，共編碼977個氨基酸；CsTMF2序列全長2 908 bp，與茶樹基因組預(yù)測的CsTMF2（GenBank：CSS0047293.1）序列相似度達99.9%，該序列包含2 904 bp開放閱讀框，共編碼967個氨基酸基，CsTMF1與CsTMF2的相似度為86.7%。

圖2 CsTMFs擴增電泳圖Fig.2 CsTMFs amplification electropherogram

2.3 茶樹CsTMFs家族保守基序與結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用MEME軟件識別2個CsTMF蛋白的10個保守Motif（圖3-A，表2），可以看出2個CsTMF的保守基序分析結(jié)果較為相似，其中，Motif 5和Motif 7分別包含TMF的2個保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)基因組數(shù)據(jù)繪制2個基因的結(jié)構(gòu)圖（圖3-B），可以看出2個CsTMF基因均包含18個內(nèi)含子。

圖3 CsTMFs保守基序（A）及基因結(jié)構(gòu)（B）Fig.3 Conserved motifs（A）and gene structures（B）of CsTMFs members

表2 CsTMFs蛋白序列中10個保守基序的詳細信息Table 2 Detailed information of 10 motifs in the CsTMFs proteins

2.4 CsTMFs蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過在線軟件Prot Param預(yù)測，CsTMF1蛋白的原子總數(shù)為15 282，分子式為C4660H7595N1367O1631S29，分子量為109.798 kD，氨基酸長度為978 aa，屬于小分子蛋白；理論等電點為4.73，表明該蛋白質(zhì)為酸性蛋白。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）：203，帶正電荷的殘基總數(shù)（精氨酸+賴氨酸）：128。不穩(wěn)定指數(shù)（II）為65.44，將蛋白質(zhì)歸類為不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)：73.50；親水性平均值（GRAVY）：-0.840。

CsTMF2蛋白的原子總數(shù)為15 139，分子式為C4623H7530N1352O1605S29，分子量為108.662 kD，氨基酸長度為968 aa，屬于小分子蛋白；理論等電點為4.78，表明該蛋白質(zhì)為酸性蛋白。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）：196，帶正電荷的殘基總數(shù)（精氨酸+賴氨酸）：125。不穩(wěn)定指數(shù)（II）計算為62.85，將蛋白質(zhì)歸類為不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)：75.56；親水性平均值（GRAVY）：-0.797。

2.5 CsTMFs二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、染色體定位和亞細胞定位預(yù)測

使用在線工具SOPMA進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，CsTMF1（圖4-A）與CsTMF2（圖4-B）中均包含大量的α-螺旋，分別占比68.20%和70.87%。CsTMF1包含隨機線圈（23.01%），以及少量的延伸鏈（5.01%）和β-轉(zhuǎn)角（3.78%）。CsTMF2包含隨機線圈（19.52%），少量的延伸鏈（5.17%）和β-轉(zhuǎn)角（4.44%）。

圖4 CsTMFs蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of CsTMFs protein

從基因組數(shù)據(jù)庫中查找CsTMFs家族2個基因的位置信息，使用TBtools軟件對目的基因進行染色體定位分析（圖5），CsTMF1與CsTMF2分別位于第2和第15染色體上。

圖5 CsTMFs家族染色體定位Fig.5 Chromosome location of CsTMFs family

使用WoLF PSORTII進行亞細胞定位，結(jié)果顯示，CsTMF1有可能定位在細胞核上，CsTMF2可能定位在細胞核或者細胞質(zhì)內(nèi)。

2.6 CsTMFs互作網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測

通過STRING在線預(yù)測了CsTMFs蛋白潛在的互作關(guān)系（圖6），以水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為參考，OsTMF主要與Ras相關(guān)蛋白Rab-6A、GTP結(jié)合蛋白Rab6相互作用，相關(guān)系數(shù)均為0.980。

圖6 STRING軟件以水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為參考預(yù)測CsTMFs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型Fig.6 Interaction network of CsTMFs based on Oryza sativa protein database by STRING software

2.7 CsTMFs系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

為了分析茶樹CsTMFs與其他植物同源蛋白的進化關(guān)系，選取水稻、紅獼猴桃、楊樹、擬南芥、玉米等20個物種中與CsTMF同源性較高的蛋白序列，使用MEGA 7軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建（圖7），茶樹CsTMFs與紅獼猴桃和中華獼猴桃TMF的親緣關(guān)系較近，而與雞血藤、大棗的TMF等親緣關(guān)系較遠。

圖7 茶樹CsTMFs系統(tǒng)進化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of CsTMFs from tea plant and other plant species

2.8 不同物種TMF蛋白同源性比對

通過公共數(shù)據(jù)庫下載5種不同物種的TMF蛋白序列（表3），使用MAFFT version 7對2個CsTMF蛋白和其他不同物種TMF蛋白進行序列比對（圖8），6個不同物種中TMF-TATA-bd與TMFDNA-bd結(jié)構(gòu)域僅有較少數(shù)氨基酸位點發(fā)生突變。

圖8 茶樹與其他植物TMF的多重序列比對Fig.8 Multiple sequence alignment of tea plant TMF with other plants

表3 不同物種TMF登錄號Table 3 Accession numbers of different species of TMF

2.9 CsTMFs表達分析

從公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫下載CsTMF1與CsTMF2在茶樹中不同組織（分別為芽、花、果實、嫩葉、成熟葉、老葉、根和莖）表達數(shù)據(jù)，對CsTMF1與CsTMF2的組織表達模式進行分析（圖9），CsTMF1與CsTMF2在茶樹的各個組織中均有表達，其中，CsTMF1在花和莖中的表達量最高，果實和老葉中表達最少；CsTMF2在成熟葉和莖中的表達較高，芽和嫩葉中表達量最少。2個基因在成熟葉、老葉和根中的表達量均相當(dāng)，CsTMF2總體表達量低于CsTMF1。

圖9 CsTMF1與CsTMF2在茶樹不同組織中的表達情況Fig.9 Expressions of CsTMF1 and CsTMF2 in different tissues of tea plant

采集冷處理和干旱處理后的舒茶早葉片進行qPCR試驗，用來分析不同脅迫下CsTMFs的表達情況。數(shù)據(jù)分別以不同處理舒茶早0 h表達量為1進行計算（圖10-A），CsTMF1在4℃處理3 h后表達量開始增高，并在第6小時達到最高值隨后開始顯著降低（P＜0.05），在第12-36小時表達量較平穩(wěn)，第48小時開始顯著升高。CsTMF1在25℃處理后的趨勢與4℃相似，均呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢，但25℃處理是在9 h達到最高值。CsTMF2在4℃處理后先顯著降低（P＜0.05），6 h有升高趨勢但是沒有達到顯著差異（P＞0.05），隨即表達量降低，在第48小時開始顯著升高。CsTMF2在25℃處理后則出現(xiàn)表達量先降低再升高再降低的趨勢，在9 h達到最高值。

圖10 CsTMFs在低溫和干旱脅迫下的表達模式Fig.10 Expression pattern of CsTMFs gene under drought stress and low temperature

CsTMF1在PEG處理后1 h表達量先顯著降低（P＜0.05，圖10-B），隨后表達量出現(xiàn)不規(guī)律的波動。CsTMF2在PEG處理后呈現(xiàn)較長時間的顯著降低，在48 h后有升高趨勢但未達到顯著差異，與0 h的表達量相比仍顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

前人研究表明，在人、小鼠、魚、酵母、水稻等物種中，TMF為單拷貝［9］，本研究對茶樹TMF進行篩選與鑒定，結(jié)果表明，茶樹中CsTMFs家族共有2個成員——CsTMF1與CsTMF2。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)CsTMFs均具有典型的TMF-DNA-bd和TMFTATA-bd結(jié)構(gòu)域，這可能是由于在2 800萬年前發(fā)生過一次全基因組重復(fù)事件，導(dǎo)致許多與茶樹抗逆性和次級代謝合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族發(fā)生了顯著擴張［16］，進一步說明茶樹基因組較為龐大且雜合程度較高。本研究進一步克隆茶樹CsTMFs的CDS區(qū)全長，證明CsTMFs在茶樹中真實存在。對茶樹CsTMFs與其他物種的TMF結(jié)構(gòu)域進行對比發(fā)現(xiàn)，TMF-DNA-bd和TMF-TATA-bd結(jié)構(gòu)域具有高度的相似性，說明該結(jié)構(gòu)域在不同物種中高度保守，與前人的研究結(jié)果一致［13］。

大量研究表明，TMF參與基因表達調(diào)控、蛋白降解、細胞內(nèi)的膜運輸?shù)龋⒃诰影l(fā)育、腫瘤發(fā)生、細胞的代謝應(yīng)激也發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。然而，TMF至今還未被納入傳統(tǒng)意義上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之中，表明該基因在植物中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制尚不明確，亟待解決。通過STRING在線預(yù)測了OsTMFs蛋白潛在的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與Ras相關(guān)蛋白Rab-6A、GTP結(jié)合蛋白Rab6相互作用，相關(guān)系數(shù)均為0.980。Rab家族不僅與細胞極性生長有關(guān)，還在植物的生物脅迫和非生物脅迫（干旱、低溫和鹽脅迫等）中起到重要作用［17］，因此，推測CsTMFs可能與植物抗逆相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)CsTMF1在花和莖中的表達量最高；CsTMF2在成熟葉和莖中表達量高，在幼嫩部位表達量低，2個基因在相同組織中表達量的差異可能預(yù)示著兩個基因的功能發(fā)生了分化。qPCR結(jié)果說明，CsTMF1在4℃和25℃處理時的表達量均為先上升后下降再上升，但是由于低溫影響，使表達量峰值從9 h提前到6 h，表明CsTMF1的表達受到低溫的誘導(dǎo)。CsTMF2的表達量在25℃處理時為先降低再升高再降低的趨勢，在4℃處理時呈下降趨勢，說明CsTMF2可能響應(yīng)低溫的影響，使CsTMF2的表達在本該升高的時間點降低，即低溫抑制了CsTMF2的表達。2個CsTMF基因在PEG處理后的表達量變化情況也不同，CsTMF1整體呈波動狀態(tài)，無明顯趨勢。CsTMF2呈現(xiàn)降低的趨勢，表明CsTMF2的表達可能受到PEG的抑制，與茶樹響應(yīng)干旱脅迫有關(guān)。

研究表明，冷脅迫下OsTMF的表達水平上升，且OsTMF與TATA順式元件的結(jié)合能力增強。細胞壁對于植物的生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用，主要表現(xiàn)在結(jié)構(gòu)支持作用、抵御逆境作用［18］，通常認為細胞壁增厚可能對細胞起保護作用。OsTMFOE水稻在2 d的冷脅迫后，次生細胞壁纖維素含量增加，次生細胞壁厚度增加，對寒冷的抵抗變?nèi)酢sTMF-OE水稻在受寒冷刺激后，OsTMF特異性結(jié)合OsBURP16、水稻纖維素合酶亞基A（cellulose synthase A，CesA）OsCesA4和OsCesA9啟動子中含TATA的區(qū)域的能力增強［10］。OsCESA4、OsCESA7和OsCESA9組成水稻次生壁纖維素復(fù)合酶［19］，OsCesA4和OsCesA9啟動后，纖維素含量增加，纖維素是細胞壁的主要成分，OsTMF-OE水稻的次生細胞壁增厚。在OsTMF的調(diào)控下OsBURP16啟動，其編碼一種前體果膠降解酶。OsBURP16過表達導(dǎo)致水稻細胞間黏附減少和耐寒性下降［20］，導(dǎo)致細胞壁中果膠降解，細胞間黏附性變低，這可能是OsTMF-OE水稻抗寒性變?nèi)醯牧硪粋€原因。一般情況下，水稻通過增加果膠含量減少纖維素合成，以應(yīng)對寒冷脅迫，因此，OsTMF對水稻耐寒性有負面影響。關(guān)于茶樹在冷脅迫下CsTMFs與細胞壁組成成分變化的關(guān)系還在進一步探究中。

4 結(jié)論

在茶樹全基因組中共鑒定出2個TMF家族基因，CDS區(qū)長度分別為2 934和2 904 bp，分別位于第2和第15染色體上，該家族基因具有組織表達特異性。CsTMFs響應(yīng)茶樹冷脅迫和干旱脅迫。