施用生物炭對連作三七根際真菌群落與存活率的影響

趙林艷 徐武美 王豪吉 王昆艷 魏富剛 楊紹周 官會林

（1.云南師范大學高原特色中藥材種植土壤質量演變退化與修復云南省野外科學觀測研究站，昆明 650500；2.云南省生態環境科學研究院，昆明 650034；3.文山苗鄉三七科技有限公司，文山 663099）

三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］為五加科人參屬植物，是我國名貴中藥材，也是復方丹參片、云南白藥、血塞通、片仔癀等中成藥的重要原料［1］，具有活血化瘀、消腫定痛的功效，常用于治療心腦血管疾病［2］。三七栽培周期一般需要3年以上，且在種植過程中大量使用化肥和農藥，使三七種植土壤板結酸化、養分富集、微生物群落失衡、病原微生物增加與化感物質積累，導致連作障礙的發生［3］。連作三七發病率可達90%以上，嚴重影響三七產業的可持續發展［4］。

生物炭是農林廢棄物在限氧環境下高溫（250-700℃）熱解產生的高度芳香化、富含碳的固態物質［5］。研究表明，生物炭作為土壤改良材料，可有效調節土壤pH、電導率，提高土壤養分含量、促進作物生長［6-7］。此外，生物炭可顯著提高土壤微生物多樣性，調節土壤微生物群落結構［8-9］。在連作障礙消減方面，周麗靖等［10］研究表明，向百合連作土中施加竹炭和稻殼炭提高了土壤有機質、堿解氮、有效磷和有效鉀含量，降低了病原菌豐度，提高了百合產量和品質。楊莉等［11-12］研究表明，向人參連作土壤中施加生物炭提高了土壤養分含量與重茬人參生物量及總皂苷含量。Wu等［13］研究表明，向太子參連作土壤中施加生物炭干擾了病原尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）的正常代謝過程，抑制了其菌絲生長，進而降低了土壤中病原菌豐度與太子參發病率。此外，施用生物炭可顯著提高白及連作土壤酶活性，調節土壤細菌群落結構，并促進白及的生長［14］。

真菌群落對土壤環境變化敏感，其生物量與多樣性受土壤溫度、水分、養分、植物群落等多種因素的影響，可間接反映土壤健康狀況［15］。研究表明，隨著三七連作年限的延長，真菌群落多樣性降低，病原鐮刀菌豐度增加，有益真菌豐度降低，是三七連作障礙的主要成因［16-17］。生物炭可有效消減百合［10］、人參［12］、太子參［13］和白及［14］等藥用植物連作障礙問題，而針對名貴中藥材三七連作障礙的田間試驗研究，還鮮見報道，其內在作用機理亦不清楚。因此，本研究以10年三七連作地為試驗對象，通過探索不同生物炭施加量對連作三七存活率、土壤理化性質、真菌群落與病原尖孢鐮刀菌豐度的影響，揭示生物炭對三七連作障礙的消減效果與內在機理，為促進三七產業可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于 2019年1月在云南文山三七科技示范園（23°31'44.48″N，104°19'13.65″E）進行，區域年平均氣溫約16.6℃，降水量約1 111 mm，土壤類型屬酸性紅壤，三七連作10年［18］，土壤pH 為6.01，電導率為201.33 μS/cm，有效氮含量為26.63 mg/kg，有效磷含量為18.21 mg/kg，有效鉀含量為157.52 mg/kg。本研究中生物炭施加量為0、12與15 t/ha，標記為T0、T1與T2，每個處理重復4次，采用隨機區組設計。每個田間試驗小區面積為6.0 m2（1.5 m×4.0 m），生物炭與表層20 cm土壤充分混勻；此外，每個小區施加0.5 kg/m2有機肥作為底肥。施用生物炭和底肥兩周后，于2019年1月移栽三七籽條，每個小區移栽200株，隨后統一澆水，不再施加肥料。在移栽18個月后，統計三七存活率；采用五點法在每個小區隨機采取5個三七根際土壤樣品，去除石礫、松針后，混合均勻，一部分自然風干、研磨過0.15 mm篩，用于土壤理化性質的測定，另一部分保存于-80℃冰箱，用于真菌群落與病原尖孢鐮刀菌的定量分析。本研究使用的生物炭是由稻殼在500℃環境下限氧熱解2 h制備而成，經粉碎后過2 mm篩，用于田間試驗，其pH為9.76，電導率為342.37 μS/cm，有效氮含量為37.56 mg/kg，有效磷含量為289.59 mg/kg，有效鉀含量為711.93 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質 土壤pH使用pH計（PHS-25）進行測定，水土比為2.5∶1；電導率使用EC計（COMBI 5000）進行測定，水土比為5∶1；土壤NH4+-N和NO3--N采用1 mol/L KCl浸提，有效鉀（AK）用1 mol/L CH3COONH4浸提，使用連續流動分析儀（SEAL AA3，SEAL Analytical，德國）進行測定；土壤有效磷（AP）用0.5 mol/L NaHCO3浸提，用鉬銻抗比色法進行測定；土壤有機質含量（OM）用重鉻酸鉀氧化法進行測定［14］。

1.2.2 土壤總DNA的提取和測序 使用BioFast試劑盒（BioFlux，中國）提取土壤樣品總DNA，使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增真菌ITS片段。PCR產物采用AMPure XP試劑盒（Beckman Coulter Life Sciences，美國）和QuantiFluorTM-ST熒光定量系統（Promega，美國）進行純化和定量。使用Illumina HiSeq 2500系統進行高通量測序。

1.2.3 土壤中尖孢鐮刀菌的定量檢測 使用熒光定量PCR系統（Heal Force GC-05，中國）對土壤中尖孢鐮刀菌的豐度進行測定。采用特異性引物ITS1 F（5'-CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和AFP 308 R（5'-CGAATTAACGCGAGTC CCAAC-3'）進行PCR擴增［19］。PCR 反應體系為：TSINGKE SYBR Green Master Mix 10 μL、引物混合液1.6 μL（正向和反向引物各 10 μmol/L）、模板DNA 1 μL，加去離子水至20 μL。PCR程序設置為：95℃保持2 min，加45個循環（95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s），每個循環在72℃時進行熒光檢測；程序運行完成后，根據溶解曲線鑒定PCR產物特征峰；標準曲線R2=0.996，擴增效率為108%。

1.2.4 數據分析 將高通量測序獲得的雙端測序數據用FLASH V1.2.7和Trimmomatic軟件進行拼接和過濾，使用UCHIME v4.2去除嵌合體，用UPARSE軟件按97%的序列相似性劃分OTUs（Operational Taxonomic Units）；使用RDP軟件以真菌ITS UNITE數據庫（https://unite.ut.ee/）為參照對不同OTU的代表性序列進行分類學注釋，使用MOTHUR軟件計算各樣品真菌OTU豐度、ACE與Chao1多樣性指數及系統發育多樣性指數（phylogenetic diversity，PD）；以上分析均利用百邁克云平臺（http://www.biocloud.net/）進行。

利用單因素方差分析與Duncan多重比較分析不同處理下三七存活率和土壤理化性質的差異顯著性；基于Bray-Curtis距離指數在OTU水平進行冗余分析（RDA）；采用相關性分析探索土壤理化性質、微生物多樣性與三七存活率之間的關聯性。以上分析利用SPSS 16.0統計軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）與R軟件“vegan”包進行。

2 結果

2.1 施用生物炭對土壤理化性質的影響

施用生物炭對土壤理化性質具有顯著影響（表1）。與T0相比，施用生物炭顯著提高了土壤pH與NO3--N、AK含量，降低了NH4+-N含量（P＜0.05）；T1處理下土壤pH、NO3--N、AK含量分別提高了17.3%、40.8%、47.39%，NH4+-N含量降低了13.22%；T2處理下土壤pH、NO3--N、AK含量分別提高了6.5%、13.6%、40.3%，NH4+-N含量降低了21.2%。

2.2 生物炭對土壤真菌群落多樣性的影響

三七種植18個月后，不同處理下各土壤樣品高通量測序共獲得908 609條真菌ITS序列，根據97.0%的相似度劃分OTU，共得到OTU 782個，隸屬于8門27綱73目131科209屬288種。不同處理下均有分布的真菌OTU數占總OTU數的8.1%，T0、T1、T2特有OTU數分別占總OTU數的12.3%、12.4%、49.2%（圖1-A）；利用稀疏標準化（rarefaction）的方法比較不同處理下真菌群落OTU豐富度（OTU richness），T2處理下真菌OTU豐富度顯著高于T0和T1（P＜0.05，圖1-B），且ACE、Chao1和PD多樣性指數較高（P＜0.05）；此外，土壤pH與真菌群落多樣性呈顯著正相關（P＜0.05，圖2）。

圖1 不同生物炭施加量處理下三七根際土壤真菌OTU豐富度Fig.1 Fungal OTU richness in the rhizosphere soil of P.notoginseng under the treatments with different biochar application amounts

圖2 不同生物炭施加量處理下三七根際土壤真菌α多樣性指數及其與土壤pH的關聯性Fig.2 α-diversity index of soil fungi in the rhizosphere of P.notoginseng and its correlation with soil pH under the treatments with different biochar application amounts

2.3 生物炭對土壤真菌群落組成的影響

在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為土壤中優勢真菌類群，在T0中的占比分別為55.8%、9.8%和17.3%，在T1中的占比分別為59.3%、9.2%和10.9%，在T2中的占比分別為31.9%、45.5%和10.0%（圖3）。在屬分類水平上，被孢霉屬（Mortierella）為土壤中的優勢真菌類群，T2處理顯著提高了被孢霉屬的相對豐度，降低了鐮刀菌屬（Fusarium）的相對豐度（圖4-A、B）。土壤中病原尖孢鐮刀菌定量分析結果表明，與T0相比，T1和T2處理顯著降低了土壤中尖孢鐮刀菌豐度（P＜0.05，圖4-C）。Spearman相關分析表明，尖孢鐮刀菌豐度與土壤pH、AK和真菌α多樣性指數呈顯著負相關，被孢霉屬相對豐度與真菌α多樣性指數呈顯著正相關（P＜0.05，圖5）。RDA分析表明，不同生物炭處理下土壤真菌群落具有明顯的分化特征，土壤pH、NH4+-N含量是影響真菌群落結構的關鍵土壤因子（圖6）。

圖3 不同生物炭施加量處理下三七根際土壤真菌門分類水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil fungi at the phylum level in the rhizosphere of P.notoginseng under the treatments with different biochar application amounts

圖4 不同生物炭施加量處理下被孢霉屬與鐮刀菌屬相對豐度及尖孢鐮刀菌豐度Fig.4 Relative abundances of Mortierella and Fusarium,and the abundances of F.oxysporum under the treatments with different biochar application amounts

圖5 土壤理化因子與被孢霉屬、鐮刀菌屬相對豐度及尖孢鐮刀菌豐度之間的關聯性Fig.5 Correlations between soil physicochemical properties and the relative abundances of Mortierella and Fusarium, and the abundances of F.oxysporum

圖6 不同生物炭施加量處理下土壤真菌群落RDA分析結果Fig.6 Redundancy analysis of soil fungal community under the treatments with different biochar application amounts

2.4 生物炭對連作三七存活率的影響

施用生物炭對連作三七存活率具有顯著影響（圖7）。三七種植18個月后，T0、T1、T2處理下三七平均存活率分別為6.0%、16.0%和30.0%；與T0相比，T1和T2處理顯著提高了三七存活率（P＜0.05，圖7）。此外，三七存活率與土壤pH、真菌α多樣性和被孢霉屬相對豐度呈顯著正相關，與土壤NH4+-N含量和尖孢鐮刀菌豐度呈顯著負相關（P＜0.05，圖8）。

圖7 不同生物炭施加量處理下三七存活率Fig.7 Survival rates of P.notoginseng under the treatments with different biochar application amounts

圖8 土壤理化性質、真菌α多樣性、被孢霉屬相對豐度、尖孢鐮刀菌豐度與三七存活率的關聯性Fig.8 Correlations between soil physicochemical properties, fungal α diversity, relative abundance of Mortierella,F.oxysporum abundance, and the survival rate of P.notoginseng

3 討論

3.1 施用生物炭影響三七連作土壤理化性質

在本研究中，施用生物炭顯著提高了三七連作土壤pH、增加了NO3--N、AK含量（表1）。楊莉等［12］也研究發現，施用稻殼炭顯著提高了人參連作土壤pH與堿解氮、有效鉀含量。生物炭對土壤pH的提升效應，可能與其灰分含量、堿性陽離子和官能團特征相關，Li等［20］研究表明，高溫制備的生物炭灰分含量與其pH呈顯著正相關。此外，生物炭施入土壤后釋放的Ca2+、Mg2+、K+等，可提高土壤pH，且生物炭表面攜帶的負電荷官能團（酚類、羧基和羥基）可結合土壤中的H+［21-22］。由于生物炭在熱解炭化過程中有機質揮發，可溶性磷酸鹽和鉀鹽含量大幅增加［23］。本研究使用的稻殼炭有效鉀含量達711.93 mg/kg，其施用后可直接增加土壤有效鉀含量。施用生物炭顯著提高了土壤NO3--N含量，這可能與生物炭的吸附效應有關。劉瑋晶等［24］研究表明，生物炭可提高土壤對NO3--N的吸附，減少淋溶，從而增加土壤中NO3--N含量。此外，生物炭可有效促進土壤硝化作用，促進NH4+向NO3-轉化［25］，這可能是施炭導致土壤中NO3--N含量增加、NH4+-N含量減少的原因之一。

3.2 施用生物炭調節連作三七根際土壤真菌群落

本研究表明，三七種植18個月后，15 t/ha生物炭處理下其根際真菌α多樣性顯著升高。同樣，Meng［26］和Tarin等［27］也發現施加生物炭可顯著提高土壤真菌α多樣性，可能是由于生物炭的高孔隙率為真菌生長提供了棲息地，有助于減少不同真菌的種間競爭，從而促進土壤中多種真菌共存［28-30］。本研究發現，施用生物炭顯著提高了土壤pH，而土壤pH與真菌α多樣性呈顯著正相關；RDA分析結果也表明，15 t/ha生物炭處理后，土壤pH是影響真菌群落結構的主要因素。因此，施用生物炭可通過提高土壤pH，間接影響土壤真菌群落［31］。

在屬分類水平上，被孢霉屬為三七根際土壤優勢菌群，且施用生物炭顯著提高了土壤中被孢霉屬的相對豐度。Miao等［17］研究發現，在健康三七根際土壤中，被孢霉屬為優勢真菌類群，其相對豐度可達44.9%。Arafat等［32］研究發現，隨著茶樹種植時間的增加，一些有益的被孢霉屬菌種（如Mortierella alpine與M.elongatula）相對豐度隨之減少；Shen等［33］研究認為，被孢霉屬是潛在的生防菌，與降低香蕉枯萎病發病率存在顯著關聯性。此外，Wang等［34］發現施用生物炭顯著增加了土壤中被孢霉屬的相對豐度，促進了水稻生長。因此，施用生物炭提高土壤中被孢霉屬的相對豐度，可能有利于連作三七的生長。

鐮刀菌屬中許多菌種會引起植物病害［35-36］，其中尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F.solani）均可引起三七根腐病［37］。在本研究中，施用生物炭顯著降低了土壤鐮刀菌屬相對豐度，且尖孢鐮刀菌豐度隨生物炭施加量的增加而顯著降低，這與Ren等［38］的研究結果一致。本研究還發現，土壤pH與尖孢鐮刀菌豐度呈顯著負相關，因此施用生物炭提高三七連作土壤pH，可能是其降低病原尖孢鐮刀菌豐度的重要原因。Li等［39］亦研究發現，生物炭可通過提高土壤pH抑制腐皮鐮刀菌孢子萌發，并影響菌絲生長。本研究表明，施用生物炭降低了土壤中銨態氮的積累，Liu等［40］研究表明，土壤NH4+-N含量可顯著影響植物根際土壤微生物群落，且常與病原菌豐度呈正相關。

3.3 施用生物炭提高連作三七存活率

本研究表明，施用生物炭有效提高了連作三七存活率，且其與土壤NH4+-N含量和尖孢鐮刀菌豐度呈顯著負相關，與pH、真菌α多樣性和被孢霉屬相對豐度呈顯著正相關。Ou等［41］研究表明，土壤中NH4+積累可脅迫三七生長，抑制三七抗病性，是導致三七減產的重要原因。此外，有研究表明，生物炭通過調節土壤pH、提高土壤養分有效性與微生物多樣性、降低病原微生物豐度，從而促進作物生長，提高作物產量，消減連作障礙問題［42-44］。如Liu等［45］研究發現，施用生物炭通過提高人參連作土壤肥力、增加真菌和細菌多樣性、降低鐮刀菌屬相對豐度，從而消減人參連作障礙。Tian等［46］研究發現，施用生物炭可有效改善土壤微生物群落結構，防治重茬西洋參根腐病。因此，施炭導致的三七連作土壤pH升高，銨態氮含量降低，被孢霉屬等有益真菌增加，病原尖孢鐮刀菌豐度降低，可能是其提高連作三七存活率、消減三七連作障礙的主要原因。

4 結論

施用生物炭通過提高三七連作土壤pH、被孢霉屬相對豐度及真菌多樣性，降低土壤銨態氮含量與病原尖孢鐮刀菌豐度，顯著提高了三七存活率，是消減三七連作障礙的有效措施。本研究為促進三七種植業可持續發展提供了科學依據，也為其他藥用植物連作障礙消減提供參考。