高效反硝化聚磷菌的篩選及其脫氮除磷條件和性能研究

袁野 周佳 屈建航 張博源 羅宇 李海峰

（河南工業大學生物工程學院，鄭州 450000）

隨著食品工業的發展，食品加工廢水已經成為污水處理的重要對象，如屠宰及肉類加工廢水［1］、豆制品廢水［2］、餐廚廢水［3］、檸檬酸生產廢水［4］等，該類廢水的主要特征為高氮高磷、生化需氧量高、懸浮物多。其中氮和磷是引起水體富營養化的限制性因素［5］。

食品加工廢水的處理多采用生物法以無氧/好氧階段交替完成［6］，處理過程依賴于不同功能的微生物，如硝化細菌、反硝化細菌和聚磷生物（polyphosphate accumulating organisms，PAOs）的共同作用，往往需要額外添加碳源來提高氮和磷的去除效率，增加運行成本［7］。反硝化聚磷菌（denitrifying phosphate accumulating organisms，DPAOs）是一種具有獨特代謝特性的反硝化細菌［8］，在消耗可用碳源時細胞產生并儲存聚β-羥基丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB），當外部碳源耗盡時，PHB可作為碳源使用，而在缺氧條件下，細胞利用亞硝酸鹽/硝酸鹽作為電子受體積累磷酸鹽［9］，從而減少氧氣需求、污泥產生以及和不同功能菌間的碳源競爭，有效緩解廢水處理工藝的壓力，提升氮磷去除效果。

目前報道的反硝化聚磷菌，種類逐步多樣化，如篩選自缺氧池中的陶厄氏菌（Thauera）［10］、好氧生物反應器活性污泥的大腸桿菌（Escherichia coli）［11］、馴化后活性污泥中的戴爾福特菌（Delftia tsuruhatensis）［12］、污染沉積物中的斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）［13］，以及產堿菌屬（Alcaligenes）、腸桿菌屬（Enterobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和芽胞桿菌屬（Bacillus）等［14］。高效反硝化聚磷菌株的篩選是脫氮除磷深入研究和應用開發的菌物基礎，但當前的菌種能力仍有非常大的提升和挖掘空間［15］。另一方面，反硝化聚磷菌應用于強化生物脫氮除磷，尤其是針對高氮高磷類廢水，研究仍相對薄弱。

本研究擬從二沉池活性污泥中篩選出高效反硝化聚磷菌，通過單因素等實驗確定其最佳工藝條件，并將其應用于不同類型食品模擬廢水的處理，以期為實際廢水的處理提供菌物參考和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 活性污泥樣品取自河南省某污水處理廠二沉池，采用取樣器收集泥水充分混合液，4℃帶回實驗室使用。

1.1.2 主要儀器與設備 恒溫培養箱，博訊實業有限公司；SIGMA3-30K高速冷凍離心機，德國Sigma Laborzentrifugen公司；C1000 Touch PCR儀，美國Bio-Rad；721型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.1.3 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基［16］（g/L）：蛋白胨10.00，牛肉膏3.00，氯化鈉5.00，pH 7.20。

R2A培養基［17］（g/L）：酵母浸出物0.50，胰蛋白胨0.50，酪氨酸0.50，葡萄糖0.50，可溶性淀粉0.50，K2HPO40.30，MgSO4·7H2O 0.05，丙酮酸鈉0.30，瓊脂15.00，pH 7.20-7.40。

1% BTB-反硝化培養基［14］（g/L）：乙酸鈉 3.01，KNO32.00，MgSO4·7H2O 0.20，瓊脂13.50，1%-BTB 4.00 mL，pH 7.20-7.40。

富氮富磷培養基［16］（g/L）：乙酸鈉 3.32，MgSO4·7H2O 0.10，CaCl20.03，K2HPO40.06，NH4Cl 0.31，KNO30.29，NaCl 0.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

微量元素［16］（g/L）：乙二胺四乙酸二鈉63.70，FeSO4·7H2O 5.00，CuSO4·5H2O 1.60，MnCl2·4H2O 5.10，CaCl25.50，ZnSO4·7H2O 2.20，鉬酸鈉1.10，CoCl2·6H2O 1.60，pH 7.20-7.40。

1.1.4 模擬廢水 屠宰及肉類加工廢水［1］（g/L）：乙酸鈉 3.34，尿素0.05，K2HPO40.08，NH4Cl 0.38，KNO30.22，NaCl 0.07，CaCl20.05，MgSO4·7H2O 0.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

檸檬酸廢水［4］（g/L）：乙酸鈉1.28，NH4Cl 0.12，KNO30.15，K2HPO40.03，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

豆制品廢水［2］（g/L）：乙酸鈉 3.85，NH4Cl 0.38，KNO30.36，K2HPO40.08，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

餐廚廢水［3］（g/L）：花生油0.05，洗滌劑0.05，乙酸鈉1.28，NaCl 0.15，NaHCO30.03，NH4Cl 0.29，KNO30.22，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O 0.01，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

1.2 方法

1.2.1 反硝化聚磷菌的篩選 10 g泥樣于裝有玻璃珠的90 mL無菌水中，充分振蕩30 min后靜置，取1 mL十倍梯度稀釋涂布于R2A培養基，設置平行。28℃培養3-4 d，挑取單菌落三區劃線法純化，點接于1% BTB-反硝化培養基，顯藍菌株為初篩菌。

初篩菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，28℃培養48 h，離心收集菌體，無菌水洗滌，重懸調OD600為1.0。以8%（V/V）接種于富氮富磷培養基，28℃培養，定時取樣，離心取上清，分別用鉬酸銨分光光度法測定總磷（TP）含量（《中華人民共和國國家標準GB 11893-89》），用紫外分光光度法測定硝酸鹽氮（NO3--N）含量（《中華人民共和國環境保護行業標準HJ/T 346-2007》），用納氏試劑分光光度法測定氨氮（NH4+-N）含量（《中華人民共和國環境保護行業標準HJ 535-2009）》，完成復篩。

1.2.2 菌種鑒定 對篩選的高效反硝化聚磷菌，依據《常見細菌系統鑒定手冊》進行形態觀察和生理生化鑒定［18］。堿裂解法提取菌體DNA，以E.coli27F和1492R為引物PCR擴增16S rRNA基因［19］，瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行核苷酸序列測定，NCBI數據庫比對并下載相似度高的序列，MEGA 7.0軟件以鄰接法構建系統發育樹［20］。

1.2.3 生長曲線和脫氮除磷曲線測定 以牛肉膏蛋白胨液體培養基接種菌株D4，150 r/min、28℃培養48 h，離心后無菌水洗滌并重懸（OD600=1.0），以8%（V/V）的接種量接種于富氮富磷培養基，150 r/min、28℃培養，每6 h測OD600及上清液中TP、NO3--N及NH4+-N含量，繪制生長曲線和脫氮除磷曲線。

1.2.4 脫氮除磷條件單因素試驗 以富氮富磷培養基為基礎培養基，分別考察碳源（葡萄糖、檸檬酸鈉、淀粉、丁二酸鈉、乙酸鈉）、乙酸鈉濃度（0.76、1.51、2.26、3.32、4.53 g/L）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，滅菌后用HCl和NaOH調節）、接種量（2%、5%、8%、10%、15%）、溫度（20、28、34、37、42℃）和初始磷含量（10、15、20、30、40 mg/L）等單因素水平對菌株脫氮除磷能力的影響。接入菌體為無菌水洗滌后重懸液（OD600為1.0）。28℃（除溫度梯度實驗外）培養48 h，取樣離心，測上清液TP、NO3--N及NH4+-N含量。

依據單因素實驗及顯著性分析結果，使用Expert Design 11.0對顯著影響D4脫氮除磷效率的溫度、pH和初始磷含量進行編碼，以總磷去除量為響應值，設置N=17的3因素3水平的Box-Behnken實驗（表1）。對總磷去除量進行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應值之間函數關系的回歸方程，根據生成的響應面圖確定最優工藝條件，完成驗證試驗。

表1 反硝化聚磷菌三因素三水平表Table 1 Three factors and three levels of denitrifying phosphorus-accumulating bacteria

1.2.5 模擬廢水的脫氮除磷性能研究 分別以屠宰及肉類加工廢水、檸檬酸廢水、豆制品廢水、餐廚廢水為對象，研究菌株D4對食品加工廢水的脫氮除磷效果。無菌水洗滌重懸后（OD600=1.0）的D4菌液按5%（V/V）分別接種至200 mL各模擬廢水，28℃、150 r/min培養，每隔12 h取樣，測定各模擬廢水中的TP、TN、NH4+-N含量，繪制脫氮除磷曲線。

2 結果

2.1 反硝化聚磷菌的篩選結果

通過初篩和復篩，得到一株高效反硝化聚磷菌株D4，在富氮富磷基礎培養基中，菌株D4的總磷去除量為7.33 mg/L，硝氮去除量為33.93 mg/L，氨氮去除量為58.65 mg/L。

2.2 菌種鑒定結果

反硝化聚磷菌D4在R2A培養基上，呈圓形、橙紅色、表面光滑、不透明，菌體細胞為短桿狀或近球狀，革蘭氏染色陽性，吲哚、V-P實驗、硝酸鹽還原實驗陽性，甲基紅實驗陰性，不能水解淀粉和尿素，不能使明膠液化。16S rRNA基因系統發育分析結果顯示（圖1），菌株D4與Gordonia hongkongensisHKU50（NR_152022.1）的親緣關系最近（同源性99.38%），結合生理生化特點，初步確定D4為戈登氏菌（Gordoniasp.）。

圖1 菌株D4的16S rRNA基因系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA genes of strain D4

2.3 反硝化聚磷菌D4的生長曲線和脫氮除磷曲線

菌株D4生長曲線及脫氮除磷曲線如圖2所示。在富氮富磷培養基中，約0-12 h為生長延滯期，對氮磷元素的消耗維持在較低水平；12-36 h為對數生長期，對氮磷的去除量逐步提高；36 h后生長趨向平穩，對氮磷的去除量也維持在相對穩定水平。

圖2 菌株D4的生長曲線和脫氮除磷曲線Fig.2 Growth and nitrogen and phosphorus removal curves of strain D4

2.4 脫氮除磷條件單因素實驗結果

2.4.1 碳源 不同碳源對菌株D4的脫氮除磷影響結果表明（圖3），同濃度條件下，乙酸鈉為菌株D4脫氮除磷的最佳碳源，檸檬酸鈉次之。對最佳碳源乙酸鈉，設置不同濃度，結果表明，當乙酸鈉濃度為3.32 g/L時，D4對總磷、硝氮和氨氮的去除量分別為8.94、28.82和64.32 mg/L，該條件下的除磷效果與乙酸鈉4.53 g/L時的差異性不顯著（P＞0.05）。當乙酸鈉濃度低于3.32 mg/L時，可能由于碳源不足影響菌株的生長進而影響了菌株的脫氮能力。因此選取3.32 g/L乙酸鈉為最佳碳源。

圖3 碳源及碳源濃度對菌株D4脫氮除磷效率的影響Fig.3 Effects of carbon sources and carbon source concentration on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of strain D4

2.4.2 接種量 接種量對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖4所示。5%接種量時，菌株對總磷、硝氮和氨氮去除量最佳，分別為8.94、31.64和62.35 mg/L。接種量低于5%時，菌株可以正常除磷，但脫氮效果受到影響，而接種量高于5%時，菌株對氨氮的去除量逐漸降低。因此選擇5%為菌株最佳接種量。

圖4 接種量對D4脫氮除磷效率的影響Fig.4 Effects of inoculum size on nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.3 初始磷含量 初始磷含量對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖5所示，15 mg/L初始磷含量條件下，菌株D4的脫氮除磷效果最佳，對總磷、硝氮和氨氮的去除量分別為12.89、32.43和62.24 mg/L。初始磷含量低于15 mg/L時，菌株的除磷能力受到限制，當初始磷含量較高時，菌株的去除硝態氮能力降低。因此選擇15 mg/L為最適初始磷含量。

圖5 初始磷含量對D4脫氮除磷效率的影響Fig.5 Effects of initial phosphorus concentration on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.4 溫度 溫度對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖6所示。28℃培養時，D4對氮磷去除量最高，對總磷、硝氮、氨氮的去除量分別為7.71、28.69和57.41 mg/L，低溫不利于該菌株對磷和氨氮的去除，而溫度過高不利于該菌株對硝氮的去除。因此選取28℃為菌株D4脫氮除磷的最適溫度。

圖6 溫度對D4脫氮除磷效率的影響Fig.6 Effects of temperature on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.5 pH pH值對菌株D4脫氮除磷效率的影響如圖7所示。pH 7-8更有利于菌株脫氮除磷，pH 8時，菌株對總磷、硝氮、氨氮的去除量分別為7.89、32.23和58.59 mg/L，此時D4的脫氮除磷能力稍高于pH 7和pH 9時，而當pH值低于7時，菌株除磷能力降低且幾乎不具有脫氮能力，可能是酸性環境不利于菌株生長，從而影響了其脫氮除磷能力。選擇pH 8為D4脫氮除磷的最適pH。

圖7 pH對D4脫氮除磷效率的影響Fig.7 Effects of pH on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.5 脫氮除磷條件的綜合優化結果

根據單因素實驗結果及顯著性分析（表2），設置N=17的三因素三水平Box-Behnken實驗，通過實驗擬合，得到總磷去除量（Y）對溫度（A）、pH（B）、初始磷含量（C）3個因素的二次多項回歸方程為：

表2 顯著性分析結果Table 2 Significance analysis results

Y=14.26+1.35A+0.5055B+2.60C-0.6770AB+1.31AC+0.0310BC-1.37A2-1.39B2-1.45C2

根據方差分析（表3），該模型的P＜0.01，說明此模型極顯著。模型系數R2為96.59%，表明該模型與實際情況擬合良好，具有統計學意義，可以用來預測反硝化聚磷菌實現最大氮磷去除量的實驗條件。3個因素對總磷去除量的影響順序為初始磷含量＞溫度＞pH，其中溫度和初始磷含量對響應值影響極顯著（P＜0.01），pH對響應值的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic model

用Design-Expert 11.0軟件對響應面實驗結果進行繪圖（圖8）表明，隨著溫度和pH的升高，D4對總磷去除量先增加后減少，溫度和pH之間存在著較強的交互作用；隨著溫度和初始磷含量的升高，D4對總磷去除量先增加后減少。隨著pH和初始磷含量的升高，菌株D4對總磷去除量先增加后減少；當溫度、pH值和初始磷含量分別為31.3℃、pH 7.9、18.61 mg/L時，響應值最大，預測總磷去除量為16.20 mg/L。

圖8 各因素交互作用對總磷去除量的響應曲面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors on total phosphorus removal

對響應面法得到的最佳脫氮除磷條件進行驗證，結果表明，菌株D4對總磷、硝氮和氨氮的實際去除量分別為14.18、39.67 和69.71 mg/L，總磷去除量與預測值基本吻合，三者的去除量比優化前分別提高了6.85、5.74和11.06 mg/L。

2.6 菌株D4對食品模擬廢水的脫氮除磷效果

菌株D4對不同食品模擬廢水的脫氮除磷結果表明（圖9），D4對豆制品廢水脫氮除磷效果最好，總磷、總氮和氨氮的去除量分別達到11.05、101.58和100.28 mg/L；對屠宰廠及肉類加工廢水中的總磷、總氮和氨氮的去除量次之，分別為10.40、92.73和77.70 mg/L；對檸檬酸廢水中的總磷、總氮和氨氮的去除量分別為5.48、21.33和19.95 mg/L。對餐廚廢水中的總磷、總氮和氨氮的去除量分別為3.48、31.19和22.33 mg/L。

圖9 菌株D4對不同模擬廢水中總磷（a）、總氮（b）、氨氮（c）的去除量Fig.9 Removed amount of total phosphorus (a), total nitrogen (b), ammonia nitrogen (c) in different simulated wastewater by bacterial strain D4

3 討論

當前廢水處理所用的反硝化聚磷菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、戴爾福特菌（Delftia tsuruhatensis）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和陶厄氏菌（Thauera）等［10-14］。本研究所篩選的高效反硝化聚磷菌戈登氏菌（Gordoniasp.），有報道用于脫硫和烴類降解［21］以及污染物的生物修復等方面［22］，關于廢水脫氮除磷的研究少有報道。

不同菌株對營養和環境的要求有所不同。本研究結果表明，在不同碳源條件下，戈登氏菌D4的生長和脫氮除磷能力均受到影響，乙酸鈉為碳源時其脫氮除磷能力最佳，與其他脫氮除磷菌相似，如不動桿菌（Acinetobactersp.）［14］等。接種量5%最佳，過低時導致微生物生物量較低，使脫氮除磷能力受到限制，當接種量過高時，則可能出現營養物質不足難以維持微生物的生長，從而影響脫氮效率［11］。初始磷含量影響微生物的生長和除磷效率，當初始磷含量低于15 mg/L時，體系中總磷含量低于D4的最大除磷能力，所以菌株的除磷能力受到限制，當初始磷含量超過20 mg/L并逐漸升高時，D4的除磷能力沒有受到顯著影響，脫氮能力有所降低，這一現象與Xu［11］等篩選出的大腸桿菌（Escherichia coli）J16恰好相反。已有研究表明，反硝化聚磷菌可以利用NO3-、NO2-和O2作為電子受體進行脫氮作用［23］。在厭氧條件下，胞內多聚磷酸鹽（ploy-P）水解為PO43-釋放到環境中，在好氧或缺氧條件下以O2或NO3-、NO2-為電子受體，同時吸取環境中的PO43-合成ploy-P儲存在胞內。在此過程中菌株受到硝酸還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶等多種酶類調節［24］，因此對外界環境因素變化較為敏感。本研究中，溫度低于28℃時，菌株的除磷能力受到影響，當溫度超過34℃時，菌株對硝態氮的去除能力隨著溫度的升高而越低。在pH 5-8，隨著pH的升高，D4的脫氮除磷能力也逐漸升高，且pH 8時D4的脫氮除磷效果最好。目前已報道的多數反硝化聚磷菌的最適生長溫度均較為溫和（25-37℃），最適pH值為中性或弱堿性（pH 6-9）［25-26］。

脫氮除磷能力方面，當前所報道的反硝化聚磷菌還遠不能滿足實際應用需求。有研究表明，一般食品加工廢水中總磷含量約為20-100 mg/L，總氮含量約為100-400 mg/L［27-28］，這些廢水在經過濾、調節pH和生物厭氧發酵分解后，進入生物反應池進行脫氮除磷，但目前報道的反硝化聚磷菌脫氮除磷能力還有待提高。聶毅磊等［29］篩選出的Achromobactersp.以琥珀酸鈉為唯一碳源，28℃培養30 h的除磷量為1.97 mg/L，脫氮量為2.76 mg/L，靳茹［30］篩選出的大腸桿菌以乙酸鈉為唯一碳源，30℃培養24 h的除磷量為8.01 mg/L，脫氮量為62.10 mg/L。王春雷［16］篩選出的反硝化聚磷菌株J3以乙酸鈉為唯一碳源，30℃培養7 d的除磷量為3.00 mg/L，脫氮量為30.10 mg/L。本研究中戈登氏菌D4以乙酸鈉為唯一碳源，31.3℃培養48 h的除磷量為14.18 mg/L，對硝態氮和氨氮的去除量分別為39.67 mg/L和69.71 mg/L，相應去除率為84.50%、97.67%和96.22%，在廢水脫氮除磷能力上具有較大的優勢，且對高氮高磷廢水的處理有良好效果，具有較好的應用前景。

4 結論

本研究篩選出一株高效反硝化聚磷菌株戈登氏菌（Gordoniasp.）D4，最佳脫氮除磷條件為3.32 g/L乙酸鈉為碳源、接種量5%、初始磷含量18.61 mg/L、31.3℃、pH 7.9，此條件下對總磷、硝氮、氨氮去除量分別達14.18、39.67和69.71 mg/L。該菌株對屠宰及肉類加工廢水、檸檬酸廢水、豆制品廢水及餐廚廢水等均具有良好的脫氮除磷效果。