楊樹NRAMP基因家族全基因組鑒定與生物信息學分析

趙志明 袁夢婷 武江昊 門艷闊 江敏 顧麗姣 王進茂

摘要 為研究楊樹自然抗性相關巨噬細胞蛋白（NRAMP）家族成員的結構和功能，利用生物信息學方法，從楊樹全基因組數據庫中篩選并鑒定NRAMP家族基因序列，并對該家族成員的理化性質、二級結構、基因結構、保守基序、染色體定位、進化樹和組織表達量進行分析。結果表明：從楊樹基因組中共鑒定出6個NRAMP基因家族成員，編碼的氨基酸數量差異較大，為503～1 310，亞細胞定位表明其均在質膜上，各個成員跨膜結構數量在10～12。PNT31315的二級結構以無規則卷曲為主，其他家族成員主要的二級結構為α-螺旋。進化樹分析表明，楊樹NRAMP家族基因全部聚類于第3類，且與玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因，不存在物種特異性。染色體定位分析表明，該家族各基因在染色體上分散分布，只有PNT48459和PNT49289兩個基因分布在一個染色體上，且不存在串聯重復和片段復制基因。蛋白功能預測結果顯示，PNT48459和PNT52668可能與植物金屬耐受蛋白結合參與金屬離子的吸收與轉運，PNT31315可能參與植物激素信號轉導。PNT48459、PNT37313和PNT31315在主根中的表達量較高，推測其參與重金屬吸收過程。

關鍵詞 楊樹；NRAMP基因家族；生信分析；重金屬脅迫

中圖分類號 S792.11? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0090-05

作者簡介 趙志明（1995—），男，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：林木遺傳育種。*通信作者，教授，博士，從事林木遺傳育種研究。

隨著我國城市化建設的不斷深入，重金屬污染問題日益嚴重，威脅生態系統，影響人類健康［ 1］。楊樹適應性較強，廣泛分布于世界各地，具有易繁殖、生長快、生物量大等特點，根系發達，對毒性物質具有較強的耐性，對重金屬具有較強的富集及轉運能力［ 2］。天然抗性相關巨噬蛋白（natural resistanceassociated macrophage protein，NRAMP）是一類參與金屬離子運輸的跨膜轉運蛋白，主要參與植物對鐵、錳、鎘等金屬離子的吸收和轉運［ 3］。NRAMP蛋白屬于一種具有典型膜整合蛋白特征多肽分子的古老膜整合轉運蛋白家族，其序列在各物種間高度保守且具有類似的二級結構［ 4］。在擬南芥中，AtNRAMP1可以高效調控植物體內鐵的吸收轉運，通過表達后期取代離子轉運過程中的鐵轉運蛋白［ 5］。AtNRAMP2與AtNRAMP1功能相似，具有錳轉運活性，在酵母中可介導錳進入胞質［ 6］。AtNRAMP3和AtNRAMP4在鐵缺乏時被誘導表達，并在種子萌發和缺錳條件下，在植株光合作用時維持所需錳離子的平衡［ 7］。AtNRAMP6定位于側根和幼嫩葉片細胞的高爾基體或反面高爾基網絡上，是Cd和Fe的轉運蛋白［ 8-9］。在水稻8個NRAMP基因家族中，成員OsNRAMP1、OsNRAMP3、OsNRAMP5、OsNRAMP6和OsNRAMP7對鋅、錳、鎘和鐵等有吸收和轉運功能［ 4，10-12］。

植物在生長過程中，如遇重金屬污染，過量的重金屬會對植物細胞膜系統造成傷害，影響植物的生長發育。如鎘脅迫時會破壞植物葉片的葉綠素結構；鉛的積累會減少植物根細胞的有絲分裂速度，使植物生長緩慢；錳雖然是植物必需的微量元素，過量則會使植物產生毒害作用，使植物生理代謝失調、生長發育受阻等。目前，NRAMP基因家族在擬南芥、水稻、甘蔗［ 13］、大麥［ 14］、馬鈴薯［ 15］、辣椒［ 16］等多種植物中均有相關研究。但很少有關于楊樹NRAMP基因家族的研究，因此，筆者利用生物信息學工具對楊樹NRAMP家族成員進行鑒定與分析，旨在后續楊樹NRAMP家族基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據來源

楊樹全基因組和基因注釋文件下載于Ensembl數據庫（http：∥plants.ensembl.org/index.html）。水稻、擬南芥、高粱、玉米和甘蔗基因組文件均下載于Ensembl數據庫。

1.2 方法

1.2.1 楊樹NRAMP基因家族的鑒定。

利用隱馬爾可夫模型保守結構域的隱馬爾可夫文件（PF01566），利用Perl程序篩選含有NRAMP結構域的蛋白序列，刪除重復序列，并通過CDD（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）、Pfam（http：∥pfam.xfam.org/）和SMART數據庫（http：∥smart.embl.de/）對候選基因進行確證，剔除無OVATE保守結構域的蛋白序列，保留下的即為楊樹PtNRAMP基因家族成員。

1.2.2 楊樹NRAMP家族蛋白理化性質、二級結構和跨膜結構分析。

利用在線網站Ex PASy（https：∥web.expasy.org/protparam/）對楊樹NRAMP家族蛋白、氨基酸數、分子量、等電點進行分析。利用在線網站wolfpsort對該家族成員蛋白序列進行亞細胞預測（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）和信號肽（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）分析。通過在線網站SOPMA（"https：∥npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測該家族蛋白的二級結構。

1.2.3 楊樹NRAMP基因保守基序和基因結構分析。

利用MEME（http：∥memesuite.org/）在線網站對NRAMP蛋白進行保守基序分析，設置Motif數量最大匹配數為10個，長度從6～50個氨基酸殘基。通過GSDS（http：∥gsds.gaolab.org/）在線網站繪制基因結構圖。

1.2.4 楊樹NRAMP家族系統進化樹的構建和染色體定位分析。

采用MEGA 7.0軟件對楊樹NRAMP基因家族蛋白進行多序列比對，運用Neighbor-joining（NJ）算法，bootstrap值取1 000，其余參數默認，構建系統發育進化樹。用Evolview在線網址（http：∥www.omicsclass.com/article/671）繪制進化樹。

利用Perl程序解析楊樹基因組注釋文件，得到染色體位置和基因結構信息，并運用Map chart工具繪制染色體定位圖。基于以下2個標準：①較短序列的長度占較長序列的70%;②2個對齊序列的相似性大于70%［ 17-18］，為片段復制基因。將位于同一染色體上且由少于5個基因間隔的同一家族基因認定為串聯重復基因［ 19］。

1.2.5 楊樹NRAMP家族基因功能預測。

通過在線網站STRING（https：∥cn.stringdb.org/）對楊樹NRAMP家族基因進行互作蛋白預測。

1.2.6 楊樹NRAMP家族基因在不同組織下的表達。

楊樹組織表達數據參考（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/？term=RNAseq%20of%20major%20tissues%20and%20xylem%20cell%20types%20of%20Populus%20trichocarpa）［ 17-18］，分析NRAMP家族基因在楊樹不同組織（莖、主根、葉、韌皮部、木質部和導管）中的表達情況。

2 結果與分析

2.1 PtNRAMP家族蛋白理化特性

通過搜索楊樹全基因組數據庫，得到6個可能是NRAMP家族的成員，提交到CDD、Pfam和SMART確定NRAMP結構域，最終確定6個序列（表1）。由表1可知，該家族成員編碼的氨基酸在503～1 310，分子量在54 630.21～142 293.19 Da，家族成員的不穩定系數在34.21～46.27，氨基酸序列的平均親水系數在-0.008～0.647，僅有PNT31315為親水蛋白，其余為疏水蛋白，亞細胞定位表明其成員均在質膜上。

2.2 PtNRAMP家族蛋白二級結構分析和跨膜結構

PtNRAMP家族蛋白二級結構主要由無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉角組成（表2）。其中，α-螺旋所占比例最高，在33.82%～57.00%；β-轉角比例最小，占比僅為2.91%～4.29%。僅PNT31315的二級結構比例表現為無規則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉角，表明其結構多變，可能是蛋白質具有特異功能的部位。6個PtNRAMP家族成員的跨膜結構數在10～12個。這表明PtNRAMP家族蛋白為跨膜蛋白，可能與其跨膜轉運重金屬離子的功能相適應。

2.3 楊樹NRAMP基因保守基序和基因結構分析

通過MEME和GSDS在線網站對楊樹NRAMP基因家族的保守基序和基因結構進行分析，結果如圖1所示，在楊樹NRAMP家族6個基因中，都含有Motif1、Motif2、Motif3和Motif6，只有PNT31315基因含有4個Motif，其余基因含有8個或10個Motif。保守基序在數量上的差異可能表明其基因與其他基因在功能上有一定差別。

基因結構分析表明，每個基因均含有內含子，且數量差別較大，最多含有12個內含子，最少的含有3個；PNT37313基因在5′末端和3′末端均不含有非翻譯區（UTR），PNT48459基因僅在5′末端不含有非翻譯區，其余4個基因有完整的基因結構。

2.4 楊樹NRAMP基因家族系統進化樹分析

為了解NRAMP基因家族在楊樹和其他物種的進化關系，構建了楊樹、水稻、擬南芥、高粱、玉米和甘蔗NRAMP家族成員的進化樹。將6個物種分為三大類（圖2），3類中都含有單子葉和雙子葉植物，表明NRAMP家族基因出現于單、雙子葉植物分離前。第1類分支中，僅有1個擬南芥和5個玉米NRAMP家族成員，第2類分支中，除了楊樹NRAMP家族成員外，其他物種均有該家族基因分布，楊樹NRAMP家族基因全部聚類于第3類，且與玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因，不存在物種特異性，說明這些基因可能具有相似的功能。

2.5 楊樹NRAMP基因家族染色體定位分析

楊樹NRAMP家族的6個基因在染色體上的分布分散（圖3），分布在1號、2號、5號、6號和7號染色體上，其余14條染色體上沒有分布，在2號染色體上分布2個該家族基因，其余4條染色體上各分布1個NRAMP家族基因。該家族基因在染色體上的分布位置不同，既有靠近染色體末端，又有近著絲粒區分布。該家族基因不存在串聯重復和片段復制。

2.6 互作蛋白預測楊樹NRAMP家族基因功能

互作蛋白預測結果顯示（圖4），有3個楊樹NRAMP家族基因蛋白存在于互作網絡上，PNT31315與ERT1、ERT3和FBL9互作，PNT48459與PtrMTP9互作，PNT52668與PtrMTP3.2、PtrMTP1、PtrMTP2和PtrMTP12互作。楊樹金屬耐受蛋白（MTPs）在植物重金屬吸收和體內平衡中起關鍵作用，PtrMTP9在酵母細胞中顯示出特定的Mn轉運能力，推測PNT48459和PNT52668可能與植物金屬耐受蛋白結合參與金屬離子的吸收與轉運。ETR1與ETR3為乙烯受體蛋白家族成員，PNT31315可能參與植物激素信號轉導。

2.7 楊樹NRAMP家族基因組織表達

為了解楊樹NRAMP家族基因的組織表達特性，該家族基因采用公開的轉錄組數據在莖、主根、葉、韌皮部、木質部和導管中的表達情況，繪制熱圖（圖5）。PNT52668在莖中表達含量高，PNT49289和PNT27203在木質部中表達含量高，PNT48459、PNT37313和PNT31315在主根中的表達量高。

3 討論與結論

楊樹是木本植物的模式物種，易于雜交和無性繁殖，具有生長迅速、生物量大等特點。楊樹可富集大量重金屬尤其是鎘，鎘濃度的增加和時間的延長使得楊樹各器官中鎘的積累量顯著增加［ 20］，在重金屬污染土壤的修復領域備受關注。因此，對楊樹NRAMP基因家族進行生物信息學分析具有重要意義。

該研究從楊樹全基因組中鑒定得到6個NRAMP基因家族成員，與擬南芥NRAMP家族6個成員，水稻NRAMP家族8個成員數量相對沒有變化，原因可能是該家族比較保守。理化性質結果表明，該家族成員中PNT31315編碼的氨基酸數為1 310，其余編碼的氨基酸數在500左右，且PNT31315為親水蛋白，其余為疏水蛋白，6個PtNRAMP家族成員的跨膜結構數在10～12個，亞細胞定位預測其成員均位于質膜上，可能與其跨膜轉運重金屬離子的功能相關。與其他植物煙草［ 21］、甘蔗NRAMP蛋白結構一致。基因結構結果顯示，該NRAMP家族所有成員均含有內含子，在基因結構中，內含子

和外顯子在一個開放閱讀框中間隔排列，發揮著不同作用，內含子不受自然選擇壓，相比于外顯子其積累了更多突變，外顯子序列通常較保守。楊樹NRAMP家族的6個基因在染色體上的分布分散，且該家族基因不存在串聯重復和片段復制，基因重復事件是基因家族成員在數量上擴張的重要原因，該家族在楊樹中可能處于保守進化。與其他物種不同，甘草NRAMP基因家族進化過程中，片段復制和串聯復制參與基因的擴增［ 22］。系統發育進化樹結果顯示，楊樹、水稻、擬南芥、高粱、玉米和甘蔗6個物種被分為三大類，楊樹NRAMP家族基因全部聚類于第3類，且與玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因，不存在物種特異性，說明這些基因可能具有相似的功能。互作蛋白功能預測結果顯示，PNT48459和PNT52668可能與植物金屬耐受蛋白結合參與金屬離子的吸收與轉運，PNT31315可能參與植物激素信號轉導。轉錄組數據表明，楊樹NRAMP家族成員在不同組織中有不同程度的表達，在主根中，PNT48459、PNT37313和PNT31315的表達量高。

筆者通過對楊樹中6個NRAMP基因家族成員的生物信息學分析，利于闡明楊樹NRAMP基因家族的功能，為楊樹應對重金屬脅迫的研究提供重要的候選基因。

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