3種黃檀屬木材DNA條形碼識別研究

余敏 張彭俐 王金波 高俊蘭

摘要 以降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材為研究對象，提取木材DNA并擴增trnL和trnS-trnG序列，比較黃檀屬候選DNA條形碼序列的擴增和測序成功率，構建系統發育樹并評價不同DNA條形碼序列的鑒定能力。結果表明：3種黃檀屬木材葉綠體編碼基因片段trnL和葉綠體基因間隔區trnS-trnG序列的PCR擴增成功率分別為82%和59%，PCR產物克隆測序成功率均為100%。候選DNA條形碼序列種間的堿基變異和插入缺失數量均高于種內。基于葉綠體編碼基因序列trnL構建的系統進化樹能夠成功區分3種黃檀屬木材。

關鍵詞 黃檀屬；DNA提取；DNA條形碼；木材識別

中圖分類號 TP391.44? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）14-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.024

作者簡介 余敏（1985—），男，河南信陽人，講師，從事木材DNA識別研究。*通信作者，副研究員，博士，從事木材生物形成研究。

DNA條形碼技術已被證實是一種科學有效的物種識別方法，該方法具有操作簡單，不受個體發育階段和形態特征的限制，鑒定快速準確等諸多優點，極大地彌補了傳統分類學方法的不足［ 1-2］。黃檀屬木材多具有較高的經濟價值，其非法采伐和非法木材貿易情況嚴重，采用傳統的木材識別方法難以準確識別到種［ 3-4］。為此，筆者以市場上3種常見的黃檀屬木材為研究對象，通過提取木材標本DNA并擴增葉綠體編碼基因片段trnL序列和葉綠體基因間隔區trnS-trnG序列，比較黃檀屬候選DNA條形碼序列的擴增和測序成功率，并對物種間穩定的變異位點進行分析，采用NJ樹法評價2條候選DNA條形碼序列的鑒定能力，以期為黃檀屬木材候

選DNA條形碼篩選和識別提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的試驗材料取自安徽農業大學木材標本館，

共選取22個試驗樣品。其中，降香黃檀（Dalbergia odorifera T.Chen）木材樣品9個，交趾黃檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre）木材樣品6個，微凹黃檀（Dalbergia retusa Hemsl.）木材樣品7個。

1.2 試驗方法

1.2.1 木材DNA的提取和純化。

木材DNA提取和純化參照已發表文獻方法進行操作［ 5］。

1.2.2 DNA條形碼序列的擴增。

分別以降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材提取純化后的DNA為模板，擴增葉綠體編碼基因片段trnL序列和葉綠體基因間隔區trnS-trnG序列。DNA條形碼PCR擴增引物信息和擴增反應體系見表1。

1.2.3 PCR產物的膠回收純化。

針對具有非特異性擴增的PCR擴增產物，需對PCR產物進行膠回收純化處理，PCR產物的純化操作采用TIANgel Midi Purification Kit進行膠回收純化。

1.2.4 PCR產物的連接和轉化。

PCR產物的連接和轉化操作按照全式金pEASY-T3 Cloning Kit操作說明進行。

1.2.5 陽性重組子的鑒定。

陽性克隆檢測采用M13通用引物擴增克隆載體插入片段區域鑒定陽性克隆。

1.2.6 DNA條形碼序列測序。

將鑒定為陽性克隆重組子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序［ 6］，為保證測序結果準確性，每個樣品選擇5個獨立的陽性克隆重組子進行測序。測序所用儀器為ABI PRISM3730xl DNA Analyzer，所測樣品均選用雙向測序。

1.2.7 DNA條形碼序列分析和系統發育樹的構建。

采用Lasergene Suite 7軟件去除引物兩端載體序列，用BioEdit（Version7.01）編輯和校正多重比對結果。采用MEGA 7軟件對黃檀屬物種間的DNA條形碼序列進行多重比對，對種間穩定的變異位點進行分析。采用鄰接法（neighborjoining，NJ）將Genbank數據庫中已公布的3種黃檀屬trnL和trnS-trnG序列（表2）和該研究中PCR產物克隆測序獲得的DNA條形碼序列構建系統發育樹，系統發育樹各分支的置信度用自舉檢驗法（bootstrap text）作1 000次可信度分析［ 7-8］。

2 結果與分析

2.1 DNA條形碼序列的擴增和測序

由圖1可知，葉綠體編碼基因片段trnL的PCR擴增效率為82%，葉綠體基因間隔區trnS-trnG的PCR擴增效率為59%。對有效擴增的DNA條形碼序列進行PCR產物克隆測序，測序成功率均為100%。PCR擴增和測序結果表明，較短的DNA條形碼序列擴增成功率高，片段越長，擴增效率越低，葉綠體基因片段的擴增成功率要高于葉綠體基因間隔片段。

2.2 DNA條形碼序列的比對和分析

通過對降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材trnL和trnS-trnG序列進行多重比對，結果表明，3種黃檀屬木材的2條候選DNA條形碼序列的種間堿基變異和插入缺失數量均高于種內，trnL序列的變異來源主要來自于堿基序列的顛換，主要發生在120～275 bp位點上。trnS-trnG序列的變異來源主要為堿基的插入/缺失，主要發生在68～74 bp和131～135 bp位點上，堿基變異轉換數量大于顛換數量（表3、4）。

2.3 3種黃檀屬木材系統發育樹聚類分析

通過對候選DNA條形碼序列trnL和trnS-trnG進行多重比對，所有對位排列結果中的空位或缺失數據作完全刪除處理，采用鄰接法（neighborjoining，NJ）構建無根系統發育樹［ 9-10］。使用trnL序列構建系統發育樹（圖2），降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀均能夠正確聚類，表現出明顯的單系性，各分支聚類支持率分別為98%、99%和99%，采用trnL序列可以將降香黃檀、交趾黃檀和微凹黃檀木材區分開來。使用trnS-trnG序列構建系統發育樹（圖3），僅降香黃檀能夠正確聚類，而交趾黃檀和微凹黃檀聚為一支，其識別成功率為33%。

3 討論與結論

從木材組織中提取的DNA溶解物呈暗黑色，這與木材組織死亡過程中鞣花單寧改變有關。邊材向心材組織轉變過程中，木材細胞老化并導致鞣花單寧逐漸氧化和聚合，使木材DNA在提取緩沖液中著色并抑制PCR擴增反應［ 11-12］。此外，木材在長期存放過程中，受到外界環境的影響造成氧化腐朽等，也將進一步損害降解木材組織中的DNA［ 13］。利用木材組織提取的DNA擴增DNA條形碼序列往往豐度較低，采用直接測序的方式往往難以得到正確結果，而采用PCR產物克隆測序的方法可大大提高測序的成功率。在該研究中3種黃檀屬木材葉綠體編碼基因片段trnL和葉綠體基因間隔區trnS-trnG序列的PCR擴增效率分別為82%和59%，克隆測序成功率均為100%。候選DNA條形碼種間的堿基變異和插入缺失數量均高于種內。基于葉綠體編碼基因序列trnL構建的系統進化樹能夠成功地將3種黃檀屬木材區分開來。

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