石蟬草總木脂素含量測定方法建立及提取工藝優選

李福森 黃媛恒 黃曉亮 李映新

摘要 ［目的］建立石蟬草總木脂素含量測定的方法并通過正交試驗優選石蟬草總木脂素的最佳提取工藝。［方法］以五味子乙素為對照品繪制標準曲線，采用變色酸－硫酸顯色體系，紫外-可見分光光度法測定石蟬草乙醇提取物中總木脂素含量；采用L9（34）正交試驗法，以總木脂素含量為考察指標，優選石蟬草總木脂素的提取工藝。［結果］五味子乙素在4.00～24.00 μg/mL線性關系良好（R2=0.996 1），平均回收率為97.68%，RSD為1.11%，石蟬草總木脂素優化的提取工藝為8倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h。［結論］該含量測定方法準確、簡便、經濟，適用于石蟬草總木脂素的含量測定，優選得到的提取工藝可為石蟬草總木脂素的提取提供參考。

關鍵詞 石蟬草；總木脂素；含量測定；提取工藝；正交試驗

中圖分類號 R284? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0183-02

作者簡介 李福森（1973—），男，廣西百色人，副教授，碩士，從事植物化學研究。*通信作者，正高級實驗師，博士，從事天然產物藥理活性研究。

收稿日期 2022-09-06；修回日期 2022-10-13

石蟬草（Peperomia dindygulensis Miq）為胡椒科草胡椒屬（Peperomia Ruiz et Pavon）植物，分布于我國南方的各省區，以全草入藥，味辛，性涼，具有清熱解毒、化疲散結、利水消腫的功效，主治肺熱咳嗽、麻疹、瘡毒、癌腫等癥［1］。《云南中草藥選》中記載用其治療胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌、肺癌。石蟬草主要含木脂素類、黃酮類、聚酮類等化學成分，其中木脂素類含量較高［2-6］，現代藥理研究發現，草胡椒屬木脂素類具有抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物、除草活性等藥理活性［2，7-10］。目前，對石蟬草開展的研究很少，其木脂素類成分的含量測定以及提取工藝研究鮮見報道。石蟬草主要木脂素成分草胡椒素A～E（peperomin A～E）多含亞甲二氧基［7］，該研究采用變色酸-硫酸顯色體系以及紫外分光光度法測定石蟬草總木脂素含量，并采用L9（34）正交試驗對石蟬草總木脂素提取條件進行優化。

1 材料與儀器

1.1 試材 石蟬草購于本地藥材市場，經廣西醫科大學生藥學教研室朱丹博士鑒定為胡椒科草胡椒屬植物石蟬草（Peperomia dindygulensis Miq）的全草，藥材粉碎后過3號篩，60 ℃干燥后備用。

1.2 試劑 五味子乙素對照品（HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號 P29J8F38066）；無水乙醇、甲醇、變色酸、硫酸均為分析純，水為純化水。

1.3 儀器 UV-1240型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；204型電子分析天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；HH-2數顯電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇友聯儀器研究所）；R1010 型旋轉蒸發器（鄭州長城科工貿有限公司）；KWY-102 型電熱干燥箱（武漢市武昌實驗儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取五味子乙素對照品 2 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為 0.2 mg/mL 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取石蟬草約10 g，加80 mL 80%乙醇回流提取3次，每次3 h，合并提取液并過濾，濾液減壓蒸干，取提取物10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。

2.3 測定波長的選擇 各取對照品溶液和供試品溶液于10 mL 刻度試管中，按照變色酸-硫酸顯色法，于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入0.5 mL 10% 變色酸水溶液、3 mL 濃硫酸， 1.5 mL蒸餾水，沸水浴中放置30 min，流水冷卻，試劑空白同法操作。于400～800 nm掃描吸收光譜，經顯色后，對照品溶液和供試品溶液均在560 nm處有最大吸收，故選擇在560 nm作為測定波長。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察。各取對照品溶液 100、200、300、400、500、600 μL 于 10 mL刻度試管中，按照“2.3”條件顯色后，于560 nm 處測吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，考察線性關系。 得到回歸方程Y=33.298X+0.048 1（R2=0.996 1），表明五味子乙素在4.00～24.00 μg/mL 線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗。取對照品溶液 400 μL，按照“2.3”條件顯色后，連續 6 次測定吸光度，計算得到吸光度的 RSD為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗。取供試品溶液 400 μL，按照“2.3”條件顯色，分別在 0、5、10、15、20、25、30 min 測定吸光度，計算得到吸光度的RSD為2.38%，表明在30 min內樣品穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗。按照“2.2”操作方法制備6份供試品溶液，各精密量取400 μL，顯色并測定吸光度，帶入標準曲線計算總木脂素含量，計算得到總木脂素含量的RSD為1.77%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗。精密量取6份已知總木脂素質量的供試品溶液，精密加入五味子乙素對照品溶液300 μL，按照標準曲線制備方法操作顯色并測定吸光度，計算樣品平均回收率及 RSD，結果見表1。

2.5 石蟬草總木脂素提取工藝優化

2.5.1 正交試驗設計。以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數（D）作為考察因素，每個因素取3個水平（表2）。稱取石蟬草粗粉50 g，共稱9份，分別按照L9（34） 正交試驗法進行提取，各組提取液過濾，回收溶劑并真空冷凍干燥至恒重。

2.5.2 正交試驗結果。分別精密稱取“2.5.1”獲得的提取物10 mg于10 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾后各取400 μL續濾液，按照“2.3”操作，將吸光度代入標準曲線，以總木脂素含量為考察指標，對試驗結果進行分析。根據直觀極差（R）分析結果（表3）可知，影響石蟬草總木脂素提取效果的因素從大到小依次為D＞C＞B＞A，最佳提取工藝為A1B3C2D3，即80%乙醇以1∶8（g∶mL）的料液比回流提取2 h，共提取3次。經過方差分析（表4）可知，提取次數、料液比、乙醇濃度、提取時間對提取效果無顯著影響。

2.5.3 驗證試驗及結果。稱取石蟬草粗粉50 g，按優選的提取工藝進行3次平行提取，得到總木脂素的平均含量為22.18 mg/g，RSD為1.72%。

3 討論

目前，中藥中總木脂素的含量測定多采用分光光度法，因天然產物中的木脂素類成分中多含亞甲二氧基，該基團于濃硫酸作用下水解生成甲醛，甲醛與含酚羥基的變色酸反應生成紫紅色產物，可以利用此特征采用分光光度法測定總木脂素含量［11］。據報道，石蟬草主要化學成分為草胡椒素A （peperomin A），具有亞甲二氧基的特征結構，五味子乙素也含有亞甲二氧基，兩者均可以在變色酸-硫酸體系中顯色，且均在560 nm處有最大吸光度［7］，因草胡椒素A標準品難獲得，故用五味子乙素作為對照品，采用分光光度法對石蟬草總木脂素類進行含量測定。方法學研究結果表明，精密度、穩定性、重復性、加樣回收率均符合規定的要求，說明該方法可用于石蟬草中總木脂素含量的測定。

通過4因素3水平正交試驗，以乙醇提取液中總木脂素含量為考察指標，優選石蟬草總木脂素的最佳提取工藝。通過試驗及數據分析，得出石蟬草總木脂素最佳提取工藝為：80%乙醇為提取試劑，以石蟬草粉末的8倍量提取3次，每次提取2 h。該研究可為石蟬草木脂素的提取和含量測定提供試驗依據。

參考文獻

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