基于核酸適配體檢測赭曲霉毒素A方法與酶聯免疫法的對比研究

鄧昌良 李泳寧 葉雅沁

摘要 ［目的］比較基于核酸適配體檢測赭曲霉毒素A（OTA）方法與酶聯免疫法。［方法］建立核酸適配體檢測OTA標準曲線，進行樣品加標回收率試驗，并與酶聯免疫法進行比較。［結果］核酸適配體法檢測OTA在0.05～10.00 ng/mL具有較好的線性，飼料樣品中添加OTA的回收率為92.0%～93.5%，與酶聯免疫法相比，2種方法之間具有較好的一致性。［結論］該研究建立的基于核酸適配體檢測OTA方法靈敏度高、準確度好，為研究飼料中OTA的快速檢測方法奠定基礎。

關鍵詞 核酸適配體；赭曲霉毒素A；檢測；酶聯免疫法；飼料

中圖分類號 S816.17? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）14-0189-03

作者簡介 鄧昌良（1990—），男，福建龍巖人，助理實驗師，從事藥物分析研究。

*通信作者，副教授，博士，從事微生態制劑研究。

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌株產生的代謝產物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA） 最為常見，具有肝腎毒性、致畸、致癌、遺傳毒性和免疫毒性等毒副作用，廣泛存在于大麥、小麥、玉米、啤酒和香料等農產品中［1-3］。而飼料中常見的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、OTA、伏馬菌素和T-2毒素等［4-6］，其中OTA是較易污染的霉菌毒素，嚴重威脅著動物和人體安全。因此，為保證飼料產品的安全使用，建立高效、快速、準確的霉菌毒素檢測方法顯得尤為重要。

目前，檢測OTA的方法主要有液相色譜法［7］、液相色譜-質譜聯用法［8］、膠體金色譜法［9］、酶聯免疫吸附法［10］和電化學傳感器法［11］等。液相色譜法是目前檢測OTA最常用的定量分析方法，靈敏度較高，但需要進行樣品純化后進行檢測；液質聯用法靈敏度可達0.1 ng/mL，但其對設備要求較高；酶聯免疫吸附法則多適用于大規模樣品的檢測，但其靈敏度和特異性也有待于提高。近年來快速發展的靈敏度高和特異性強的核酸適配體檢測技術，成為國內外的研究熱點。該研究前期已建立了基于核酸適配體的赭曲霉毒素A檢測方法［12］，在此將該方法用于飼料樣品中OTA的檢測并與酶聯免疫法進行比較，考察該方法建立的準確性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）為北京Solarbio公司產品，鏈親和素購為上海源葉生物公司產品，牛血清白蛋白（BSA）和OTA為美國Sigma-aldrich公司產品；OTA核酸適配體5′-biotin-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-Cy3-3′，結合序列5′- BHQ2-TGTCCGATGC-3′由福州尚亞公司合成。赭曲霉毒素A酶聯免疫反應檢測試劑盒為美國REAGEN公司產品。其他試劑均為分析純。多功能酶標儀（SpectraMax M3）為美國MD公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 核酸適配體法檢測OTA。在96孔微孔板中加入100 μL 鏈親和素 （100 μg/mL），4 ℃包被過夜。扣干，用PBS緩沖液清洗3次，再次扣干；用1%BSA進行封閉2 h后，用PBS緩沖液清洗3次，扣干。加入100 μL核酸適配體（200 nmol/L），25 ℃振蕩孵育30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。再加入100 μL的標準品溶液或提取后的樣液，37 ℃反應30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。最后加入100 μL互補序列（400 nmol/L），37 ℃反應30 min，PBS緩沖液清洗3次，扣干。采用酶標儀檢測熒光強度，激發波長為550 nm，吸收波長為570 nm［12］。OTA標準曲線的測定，將OTA標準品采用甲醇進行溶解，再用HEPES緩沖液 （pH 7.0，120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl2、20 mmol/L CaCl2）稀釋成0、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL標準液，標準液加至已經加入100 μL核酸適配體按上述方法進行加樣檢測，采用酶標儀檢測熒光強度，根據標準品濃度與熒光強度制作標準曲線。

1.2.2 酶聯免疫法檢測OTA。

根據赭曲霉毒素A酶聯免疫反應檢測試劑盒說明書進行檢測。加入50 μL的標準品或樣品于所設定的孔中；每孔加入50 μL一抗，振蕩混勻 1 min；37 ℃下避光溫育30 min；倒掉板孔內液體，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后將酶標板倒置用力甩干；每孔加入100 μL二抗，振蕩混勻1 min；37 ℃下避光溫育30 min；倒掉板孔內液體，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后將酶標板倒置用力甩干。加入100 μL 四甲基聯苯胺，混勻1 min，室溫（22.5±2.5）℃溫育15～20 min，加入50 μL終止液；酶標儀450 nm下讀OD值。OTA標準曲線的測定，用檢測試劑盒中已配好OTA標準液（0、1、3、9、27、81 ng/mL），按上述方法進行加樣檢測，采用酶標儀于450 nm波長處測定OD值，根據標準品濃度與相對吸光度制作標準曲線。

1.2.3 飼料樣品處理及加標回收率測試。從市場收飼料樣品數個，粉碎后備用。根據赭曲霉毒素A酶聯免疫反應檢測試劑盒說明書，準確稱取2.0 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加10 mL 70%甲醇，振蕩5 min，室溫下4 000 r/min離心10 min；取1 mL上清，加入1 mL碳酸氫鈉溶液（0.1 mol/L），振蕩，取50 μL進行分析。選擇未檢出OTA的飼料樣品進行加標回收率試驗，分別向2.00 g飼料粉碎樣品中添加OTA標準品（通過液體稀釋后加入），使其樣品中含有1.0和10.0 ng/g OTA，提取后采用酶聯免疫法和核酸適配體法進行檢測樣品中OTA含量，計算加標回收率。

2 結果與分析

2.1 OTA標準曲線的建立

將OTA標準品溶液稀釋成不同濃度標準液，分別加至已包被好的96孔微孔板中，按“1.2.1”和“1.2.2”方法反應后，采用酶標儀檢測熒光強度，根據標準品濃度與熒光強度制作標準曲線。酶聯免疫法則按說明書進行操作，根據標準品濃度和相對吸光度制作標準曲線。結果如圖1所示。

從圖1可以看出，核酸適配體法在OTA濃度0.05～10.00 ng/mL建立標準曲線，其標準方程為Y = 4 543X+11 739（R2=0.986 1），最低檢測限為0.05 ng/mL；而根據酶聯免疫法檢測試劑盒說明書在1～81 ng/mL建立標準曲線，其標準方程為Y=-30.31X+74.86（R2=0.995 8），最低檢測限為1.00 ng/mL。

2.2 飼料樣品中OTA的檢測

從市場收集飼料樣品數個，根據OTA酶聯免疫反應檢測試劑盒說明書進行提取，選擇未檢出OTA的飼料樣品進行加標回收率試驗，分別采用核酸適配體法和酶聯免疫法進行測定，計算飼料樣品的OTA回收率，結果如表1所示。

從表1可以看出，在飼料樣品中添加OTA標準品，采用2種方法進行檢測，其檢測值具有較好的一致性。在飼料樣品中OTA標準品添加量1.0 ng/g，核酸適配體法檢測的回收率為92.0%，略高于酶聯免疫法（89.0%）；在飼料樣品中添加10.0 ng/g OTA標準品，則酶聯免疫法檢測的平均回收率（95.8%）略高于核酸適配體法（93.5%）。可見，該研究建立的核酸適配體法具有較好的準確度。

2.3 2種方法的比較

從表2可以看出，核酸適配體法檢測靈敏度較高，檢測限達到0.05 ng/mL，且反應時間較短（反應時間從加入待測樣品或標準品進行反應開始計算），工作中OTA標準品的回收率為92.0%～93.5%，表明該研究建立的檢測方法具有較高的準確度。而與酶聯免疫法相比，由于酶聯免疫法采用的是顯色法，其檢測限較低，僅有1.00 ng/mL，但在較高濃度樣品的檢測中具有較高的回收率。

3 結論與討論

近年來，食品、農產品和飼料中的霉菌毒素污染時有報道，特別是農產品和飼料產品，不僅影響動物生長和繁殖，并且可能隨著食物鏈進入人體，進而對人體健康造成一系列嚴重的安全問題，其安全性越來越受到人們重視。因此，為保障食品、農產品和飼料的安全使用，建立新型的高靈敏霉菌毒素檢測方法是保障其安全的重要手段。

目前，已有大量的新型檢測技術被應用于霉菌毒素的檢測方法，特別是近年來報道了大量能特異性結合霉菌毒素的核酸適配體［13］，也開發了基于核酸適配體檢測黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等的檢測方法［14-16］。核酸適配體是一段能與目標物進行特異性結合的寡核苷酸序列，由于其核酸特性，具有容易合成、反復使用和保存等的優點。因此，國內外已有報道了多種基于核酸適配體檢測OTA的技術方法［17］，如Wei 等［18］開發了一種新的基于核酸適配體檢測OTA的電化學生物傳感器，采用碳氣凝膠和亞甲基藍（MB）作為信號放大策略，其檢測線性范圍為0.10～10.00 ng/mL，實際檢測限可達到1.0×10-4 ng/mL。Li等［19］建立了一種基于核酸適配體檢測谷物樣品中的多重真菌毒素的新型高通量光子晶體微球懸浮陣列，該檢測系統OTA的檢測范圍可達到0.1 pg/mL～0.1 ng/mL。曲瑤等［20］開發了基于核酸適配體檢測OTA的傳感器，其檢出限達到0.67 nmol/L。以上方法的檢測靈敏度均較高，可以對飼料和農產品中的痕量霉菌毒素進行分析檢測，但由于檢測操作和設備要求上都較高，難以在大量樣品的分析檢測中進行應用。

該研究建立的基于核酸適配體檢測OTA的方法，操作簡單、靈敏度高，檢測濃度為0.05～10.00 ng/mL，最低檢測限可達到0.05 ng/mL，在飼料樣品中加標回收率高，與酶聯免疫法相比具有較好的一致性，不僅可以作為大規模樣品分析檢測的方法，同時也為建立檢測多元霉菌毒素的新型分析方法奠定基礎。

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