蒜頭果蛋白氨基酸組成分析

袁燕 宋鵬飛 菅博書 崔穆峰

摘要 采用酸水解法測定蒜頭果蛋白的氨基酸組成，結果發現，蒜頭果蛋白的氨基酸組成豐富，含有17種氨基酸。根據其精確分子量推算，得出每個蒜頭果蛋白分子的各氨基酸殘基數約為503個。其中酸性和堿性氨基酸殘基含量分別為23.06%和13.32%，說明蒜頭果蛋白是一種酸性蛋白質；親水作用較強的氨基酸殘基占總氨基酸殘基數的50.3%，說明該蛋白在水溶液中的溶解性比較好，便于用09%生理鹽水溶解其干粉樣品，為蒜頭果蛋白作為藥品的開發利用提供了便利條件。

關鍵詞 蒜頭果蛋白；酸水解；氨基酸組成

中圖分類號 Q517? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）14-0192-02

作者簡介 袁燕（1975—），女，江西新余人，副教授，博士，從事蛋白質的分離純化及分子作用機制研究。

蒜頭果（Malania oleifera Chun et S.Lee）又名猴子果、山桐果、馬蘭后（壯語）等［1］，屬于鐵青樹科（Olacaceae）蒜頭果屬，是我國特有的單種屬稀有植物［2］，已被列為國家二級保護樹種、廣西重點保護野生植物［3］。在自然界分布很窄，僅見于我國廣西西部的大新、龍州、右江流域各縣和云南東部的富寧、廣南等地。蒜頭果種子中富含油脂，含油率高達670%，主要成分為油酸、硬脂酸和棕櫚酸，可作為合成麝香酮的理想原料，具有較高的經濟價值［4-5］。

蒜頭果蛋白是從蒜頭果種子中分離純化出來的一種新的Ⅱ型核糖體失活蛋白。該蛋白具有非常強的抗腫瘤活性，對人宮頸癌HeLa細胞的半抑制濃度（IC50）為1.54×10-10 mol/L，其IC50值均遠遠小于具有抗腫瘤、抗病毒活性的天花粉蛋白（4.10×10-5 mol/L）和廣譜抗癌藥物順鉑（1.59×10-6 mol/L），說明該蛋白具有用于免疫毒素治療癌癥的應用前景［6］。由于蒜頭果蛋白的氨基酸序列還未知，為了更清楚地了解其抗腫瘤活性及結構的關系，該研究采用酸水解法測定蒜頭果蛋白的氨基酸組成，為后續研究蒜頭果蛋白的一級結構打下基礎。

1 材料與方法

1.1 設備與試劑

氨基酸自動分析儀（日立835-50型）；蛋白純化系統（KTA Explorer 100，Amersham）；Milli-Q純水機（MILLIRORE公司）；萬分之一天平（Sartorius，BP110S）。100 μmol/L 17種氨基酸標準液（Beckman）；其余試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒜頭果蛋白樣品的獲取。

將200 g蒜頭果種子去外殼，按種仁與20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液1∶5比例用組織搗碎機搗碎，紗布過濾，離心（8 000 r/min，4 ℃），上清液用30%～80%硫酸銨分段鹽析，離心（8 000 r/min，4 ℃），沉淀用20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液溶解，在蛋白質純化系統上過柱體積為20 mL的疏水色譜層析柱［HiprepTM phenyl FF（High sub）］，用ddH2O按0～100%線性梯度洗脫，280 nm紫外檢測，流速為4 mL/min，每管5 mL自動收集［7］。樣品純度用12.0% SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.2 蒜頭果蛋白樣品的水解。準確稱取1.000 mg蒜頭果蛋白樣品于水解試管中，加6 mol/L HCl溶液2～4 mL，混勻后放入冷凍劑中，冷凍3～5 min后抽真空，充入氮氣30 s，立即旋緊蓋子，110 ℃水解22 h，待玻璃管冷卻后開管，水解液在70～80 ℃水浴中蒸干，加少量蒸餾水再蒸干，重復3次［8］。

1.2.3 蒜頭果蛋白氨基酸組成的測定。將HCl揮發后的樣品用適量pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，0.4 μm微孔濾膜抽濾或13 000 r/min離心15 min，濾液或上清液于氨基酸自動分析儀進行分析各氨基酸的含量［9］。

2 結果與分析

2.1 蒜頭果蛋白樣品的獲取

圖1為蒜頭果蛋白樣品在蛋白純化系統上分離純化的色譜層析圖。從圖1可以看出，主要有4個峰，分別標為峰I、峰Ⅱ、峰Ⅲ和峰Ⅳ，通過SDS-PAGE電泳檢測發現峰Ⅳ即為蒜頭果蛋白，收集峰Ⅳ溶液，真空冷凍干燥成干粉，置于4 ℃冰箱中保存備用。

2.2 蒜頭果蛋白氨基酸組成分析

2.2.1 氨基酸組成分析。從圖2和表1可以看出，蒜頭果蛋白的氨基酸組成豐富，含有17種氨基酸組分。根據各氨基酸的摩爾百分比和蒜頭果蛋白精確分子量（61 875 Da）推算出在蒜頭果蛋白分子中各種氨基酸的個數，總和為503個。其中脂肪族氨基酸基為86.88%（共437個）；芳香族氨基酸殘基為5.76%（共29個）；雜環族氨基酸占7.36%（共37個）。酸性氨基酸殘基及其酰胺為23.06%（共116個）；堿性氨基酸殘基為13.32%（共67個），說明蒜頭果蛋白是一種酸性蛋白質，這與蒜頭果蛋白的等電點為5.5是一致的。

在蒜頭果蛋白總氨基酸殘基數中，以天冬氨酸（67個）為最多，達14.4%，這里可能包括天門冬酰胺，因為天門冬酰胺在有酸或堿存在下容易水解并生成天冬氨酸。天冬氨酸和含量排第三的谷氨酸（可能包括谷氨酰胺）同屬于酸性氨基酸［6］，一般帶負電荷，以酸根形式存在，在蛋白質內以鹽鍵形式與正電荷基團連接。谷氨酸的帶負電荷的γ-羧基常位于蛋白質分子表面，能與鈣結合，可能蒜頭果蛋白含有非常高的鈣離子。

在總氨基酸殘基數中，殘基數排第三的是絲氨酸（49個），它與含量比較高的蘇氨酸（32個）同屬于羥基氨基酸。由于側鏈帶有極性基團，具有一定的親水性。氨基酸殘基帶有羥基側鏈者化學上比較活潑，常作為活性殘基而進行研究其功能具有十分重要的意義。

2.2.2 疏水性和親水性分析。從表1可以看出，蒜頭果蛋白中具有較強疏水作用的亮氨酸（39個）、纈氨酸（36個）、脯氨酸（29個）、異亮氨酸（20個）、苯丙氨酸（16個）和甲硫氨酸（2個）等殘基占總氨基酸殘基數的29.7%，說明蒜頭果蛋白的疏水作用比較強，這與“1.2.1”試驗中用疏水色譜層析柱一步就可以將該蛋白分離純化出來的結果是一致的。

此外，蒜頭果蛋白中具有較強親水作用的絲氨酸（49個）、蘇氨酸（32個）、天冬氨酸（67個）、谷氨酸（49個）、精氨酸（47個）和賴氨酸（12個）等殘基占總氨基酸殘基數的50.3%，由此可以推斷蒜頭果蛋白在水溶液中的溶解性比較好，便于用0.9%生理鹽水溶解蒜頭果蛋白干粉樣品，為蒜頭果蛋白作為藥品的使用提供了便利條件。

3 討論與結論

蛋白質氨基酸組成的測定方法主要有酸水解、堿水解和酶水解，在水解過程中，逐漸降解成分子量越來越小的肽段，直到最后成為氨基酸的混合物。酶水解不產生消旋作用，也不破壞氨基酸，但水解不徹底，需要幾種酶協同作用才能使蛋白質完全水解，且需要時間較長，所以主要用于蛋白質部分水解，在氨基酸組成測定中用的較少。堿水解一般與5 mol/L NaOH共煮10～20 h，可使蛋白質完全水解，但水解過程中多數氨基酸遭到不同程度的破壞，且產生消旋現象，不過色氨酸卻是穩定的［10］。酸水解是氨基酸組成測定方法中最常用的方法，其優點是不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸，缺點是色氨酸完全被沸酸所破壞，羥基氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸）有一小部分被分解，同時酰胺基被水解下來［11］。該研究采用酸水解法測定蒜頭果蛋白的氨基酸組成，雖然在該試驗中沒有色氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺的數據，但根據蒜頭果蛋白精確分子量已推算出每個蛋白質分子中各氨基酸殘基數的近似值為503個，是一種酸性蛋白質，可能含有非常高的鈣離子，疏水作用比較強，水溶性也很好，此結果為后期深入研究蒜頭果蛋白結構與功能關系奠定基礎。

參考文獻

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第24卷［M］.北京：科學出版社，1988.

［2］ 傅立國.中國植物紅皮書：稀有瀕危植物（第一冊）［M］.北京：科學出版社，1992：480.

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［11］ 沈同，王鏡巖.生物化學［M］.2版.北京：高等教育出版社，1990：196-224.