不同胚胎發(fā)育速度對凍融單囊胚移植妊娠結局的影響

張慶，邱乒乒，紀紅，石健，王龍梅，丁露，姜雨飛，陳榮卷，李萍*

(1.廈門大學附屬婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學科,廈門 361005;2.廈門市生殖與遺傳重點實驗室,廈門 361005)

多胎妊娠是輔助生殖技術(ART)治療的一種嚴重并發(fā)癥。隨著ART技術的進步,在提高妊娠率的同時,降低多胎率已成為臨床工作者亟需解決的問題。而挑選出最具發(fā)育潛能的囊胚進行單囊胚移植,可以在保證妊娠的同時降低多胎的風險。形態(tài)學評分是目前應用最為普遍的囊胚評級方法。通過囊胚的外滋養(yǎng)層細胞和內細胞團的形態(tài)學評分可以對其發(fā)育潛能進行篩選。但是胚胎發(fā)育是多階段的過程,因此僅通過囊胚期的形態(tài)學評價對其發(fā)育潛能進行評估尚不夠準確。國內外已有很多的研究表明囊胚發(fā)育天數與囊胚移植的妊娠結局具有相關性,但是結果尚存在爭議[1-3]。目前研究的焦點多集中在囊胚發(fā)育天數是否對其妊娠結局有影響;其次是在選擇囊胚移植時,不同發(fā)育天數和囊胚的形態(tài)學評級兩者如何進行抉擇。本中心為了盡早將完全擴張的囊胚進行冷凍,增加了第5天(D5)下午的囊胚觀察時點。本研究通過回顧性分析,研究D5上午、D5下午及D6不同發(fā)育速度的囊胚移植后妊娠結局的差異,探討囊胚發(fā)育速度和級別對臨床妊娠率的影響,以期進一步優(yōu)化臨床實踐中胚胎篩選方法,提高臨床妊娠率,改善妊娠結局。

資料與方法

一、研究對象

選擇2017年1月至2022年5月在廈門大學附屬婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學科首次進行凍融單囊胚移植的患者為研究對象。納入標準:(1)在我中心首次進行凍融單囊胚移植的患者;(2)女方年齡<45歲。排除標準:供卵、供精者及存在反復流產史者。

本研究共納入1 744個周期的患者資料,根據囊胚形成時間分為D5上午組1 482個周期,D5下午組174個周期,D6組88個周期;又按照女方年齡進行分組:≤35歲組1 557個周期,>35～<40歲組149個周期,≥40歲組38個周期。回顧性分析行凍融單囊胚移植后患者的臨床妊娠結局。

二、研究方法

1.囊胚培養(yǎng):1 744例患者均采用常規(guī)促排卵方案,獲卵后根據患者丈夫精液情況分別采用常規(guī)體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)授精。授精后16～18 h觀察并記錄受精情況;培養(yǎng)至D3時觀察胚胎卵裂情況,將其轉移至K-SIBM培養(yǎng)基(Sydney IVF Blastocyst Medium,澳大利亞)中行囊胚培養(yǎng)。

2.囊胚評分:參照Gardner囊胚評分標準進行囊胚評級。頂級囊胚為內細胞團和外滋養(yǎng)層細胞評級為AA、AB、BA的囊胚;中等囊胚為內細胞團和外滋養(yǎng)層細胞評級為BB的囊胚;差囊胚為外滋養(yǎng)層細胞評級為C且內細胞團評級為B級或B級以上的囊胚。本中心盡可能等待囊胚發(fā)育至4期及以上再進行冷凍,因此D5上午和下午及D6上午均進行囊胚觀察并對可用囊胚進行冷凍。本中心的可用囊胚包括頂級囊胚、中等囊胚及差囊胚3類,其中頂級囊胚和中等囊胚為優(yōu)質囊胚。

3.囊胚解凍及移植:采用人工周期或自然周期準備內膜,在黃體支持5 d后進行超聲引導下囊胚移植。囊胚在移植前6 h解凍并體外培養(yǎng)。移植后12 d抽血測β-HCG,陽性者診斷為HCG陽性。移植后30 d行陰道B超檢查見孕囊者診斷為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%;活產率=分娩活嬰(雙胎/多胎按1例計算)數/移植周期數×100%;流產率=(早期流產數+晚期流產數)/臨床妊娠數×100%。因部分患者仍在持續(xù)妊娠中,活產率計算的移植周期數為2021年12月31日之前移植的周期數。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行數據處理,多組計量資料用中位數和四分位數間距表示,平均值比較采用Kruskal Wallis檢驗,計數資料中率(%)的比較采用χ2檢驗;兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗水平,以P<0.05/n(n=3,即P<0.016 7)為差異有統(tǒng)計學意義。采用多因素Logistic回歸分析臨床妊娠的影響因素。

結 果

一、各組患者基礎資料及妊娠結局比較

在≤35歲組中,不同發(fā)育速度組間的女方年齡、體質量指數(BMI)、基礎FSH及基礎子宮內膜厚度進行兩兩比較,部分組間存在顯著性差異(P<0.016 7);在>35～<40歲組和≥40歲組中,不同發(fā)育速度組患者的基本資料均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同年齡組中不同發(fā)育速度各組基本資料及妊娠結局比較[M(P25,P75),%]

在≤35歲組中,D5上午組與D5下午和D6組間的HCG陽性率、臨床妊娠率、活產率存在顯著性差異(P<0.016 7);D5下午和D6組間HCG陽性率、臨床妊娠率、活產率無顯著性差異(P>0.016 7);3組間隨著胚胎發(fā)育時間延長流產率呈現升高趨勢,但組間均無顯著性差異(P>0.016 7)。>35～<40歲組中不同發(fā)育速度組間HCG陽性率、流產率和活產率兩兩比較,部分組間存在顯著性差異(P<0.016 7);D5上午組與D5下午和D6組間的HCG陽性率、活產率存在顯著性差異(P<0.016 7);D5下午和D6組間HCG陽性率、活產率無顯著性差異(P>0.016 7);3組間流產率僅有D5上午和D6組間存在顯著性差異(P<0.016 7)。≥40歲組中不同發(fā)育速度組間妊娠結局均無顯著性差異(P>0.016 7)(表1)。

二、不同形態(tài)學評分D5上午囊胚移植周期的基礎資料及妊娠結局比較

按照D5上午囊胚形態(tài)學評分分為頂級囊胚組(359個周期,占比24.22%)、中等囊胚組(864個周期,占比58.30%)和差囊胚組(259個周期,占比17.48%)。3組的女方年齡和基礎FSH存在顯著性差異(P<0.05),差囊胚組的女方年齡顯著高于其他兩組,基礎FSH顯著高于頂級囊胚組(P<0.016 7);不孕年限、BMI和內膜厚度3組無顯著性差異(P>0.05)。差囊胚組的HCG陽性率和臨床妊娠率顯著低于頂級囊胚和中等囊胚組(P<0.016 7);3組的活產率和流產率比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同形態(tài)學評分D5上午囊胚移植周期的基礎資料及妊娠結局比較[M(P25,P75),%]

三、不同形態(tài)學評分D5下午囊胚移植周期的基礎資料及妊娠結局比較

按照D5下午囊胚形態(tài)學評分分為頂級囊胚組(8個周期,占比4.60%)、中等囊胚組(66個周期,占比37.93%)和差囊胚組(100個周期,占比57.47%)。3組的不孕年限、BMI、基礎FSH和內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05);中等囊胚組的女方年齡顯著小于差囊胚組,而臨床妊娠率顯著高于差囊胚組(P<0.016 7);3組間HCG陽性率總體存在顯著性差異(P<0.05),但是組間兩兩比較無顯著性差異(P>0.016 7);3組間流產率和活產率兩兩比較后亦無顯著性差異(P>0.016 7)(表3)。

表3 不同形態(tài)學評分D5下午囊胚移植周期的基礎資料及妊娠結局比較[M(P25,P75),%]

四、不同形態(tài)學評分D6囊胚移植周期的基礎資料及妊娠結局比較

按照D6囊胚形態(tài)學評分分為頂級囊胚組(0個周期)、中等囊胚組(17個周期,占比19.32%)和差囊胚組(71個周期,占比80.68%)。差囊胚組的女方年齡和基礎FSH顯著高于中等囊胚組(P<0.05);兩組間不孕年限、BMI和內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05),HCG陽性率、臨床妊娠率、流產率及活產率比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同形態(tài)學評分D6囊胚移植周期的基礎資料及妊娠結局比較[M(P25,P75),%]

五、多因素Logistic回歸分析

以臨床妊娠為因變量,以女方年齡、BMI、胚胎發(fā)育天數、囊胚評級、不孕年限、基礎FSH、內膜厚度為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,BMI、不孕年限、基礎FSH和內膜厚度對臨床妊娠的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05);女方年齡、胚胎發(fā)育天數和囊胚評級對臨床妊娠具有統(tǒng)計學影響(P<0.05)(表5)。

表5 多因素Logistic回歸分析各因素對臨床妊娠的影響

討 論

關于胚胎進入囊胚期的時間對體外受精結果的影響是過去10年中輔助生殖領域研究的熱點,但目前尚未得出一致結論。大多數關于新鮮周期的研究表明,在D5移植的胚胎比D6移植的胚胎更有優(yōu)勢[4-5]。而對于凍融胚胎的研究則發(fā)現,冷凍保存處于相同發(fā)育階段的D6胚胎與D5胚胎,具有相似的臨床妊娠率和活產率[6]。還有研究發(fā)現無論胚胎質量如何,冷凍和新鮮周期移植D5囊胚的臨床妊娠率和活產率都高于D6囊胚[3],這與之前的回顧性研究[7-8]的結果一致。造成這種差異的原因可能是由于早期采用慢速冷凍法進行胚胎冷凍,現階段主要采用玻璃化冷凍的方法導致。本研究的目的是比較移植D5和D6凍融囊胚的臨床結局。為了控制盡可能多的混雜因素,分析了首次進行凍融胚胎移植的患者。為了精確研究囊胚發(fā)育速度對于妊娠結局的影響,進一步將D5發(fā)育囊胚進行了細分,分為D5上午組和D5下午組;按照女方年齡又將患者進行了分層分析,分為≤35歲組、>35～<40歲組和≥40歲組。研究結果顯示,在3個年齡組中不同囊胚發(fā)育速度亞組的妊娠結局有顯著性差異;在≤35歲組和>35～<40歲組中D5上午囊胚移植的妊娠結局顯著優(yōu)于D5下午和D6組。囊胚發(fā)育速度和妊娠率的關系與近年來的研究[9]結果一致。需要注意的是≤35歲組中患者的年齡和基礎FSH及內膜厚度進行兩兩比較,部分組間存在顯著性差異(P<0.05),可能是由于D5下午和D6數據量較少導致的統(tǒng)計誤差。在>35～<40歲組中D5上午組與D5下午和D6組間的HCG陽性率、活產率存在顯著性差異,流產率僅在D5上午和D6組間存在顯著性差異(P均<0.016 7)。但是在≥40歲組中不同囊胚發(fā)育速度亞組間的基礎資料和妊娠結局均無顯著性差異(P>0.016 7)。這可能是由于≤35歲組患者的卵母細胞質量較好,其發(fā)育而來的胚胎質量相對更好,發(fā)育速度較快,妊娠結局更好,這會導致發(fā)育速度快的囊胚和發(fā)育速度慢的囊胚的妊娠結局的差異性更加明顯;另一方面可能是由于D6組和≥40歲組患者數量較少,統(tǒng)計分析時存在一些偏倚。是否隨著女方年齡的增長,囊胚發(fā)育速度對妊娠結局的影響作用越來越小還需要進一步擴大樣本進行研究。

為了進一步研究造成D5和D6囊胚移植妊娠結局差異的原因,本研究對同樣發(fā)育速度的囊胚按照形態(tài)學評級進行了分組。結果顯示,隨著囊胚發(fā)育速度的減緩優(yōu)質囊胚和頂級囊胚的比例也在下降。頂級囊胚發(fā)育速度一般較快,傾向于在D5上午或者D5下午發(fā)育至4期(本中心囊胚冷凍標準為囊胚腔發(fā)育至4期以上進行冷凍)。頂級囊胚在不同發(fā)育速度組中的比例隨著發(fā)育時間延長越來越低,D5上午組、D5下午組和D6組分別為24.22%、4.60%和0.00%;中等囊胚在各組中的比例也隨著發(fā)育時間延長而下降,D5上午組、D5下午組和D6組分別為58.30%、37.93%和19.32%。在頂級囊胚中,D5上午囊胚移植的臨床妊娠率與D5下午囊胚相當(62.12% vs. 62.50%),而流產率有低于D5下午囊胚的趨勢(17.04% vs. 20.00%)。提示隨著囊胚發(fā)育速度的減緩,D5上午頂級囊胚的臨床妊娠結局有優(yōu)于D5下午的趨勢。中等囊胚的活產率隨著發(fā)育時間的延長呈現下降的趨勢,D5上午、D5下午和D6囊胚移植時分別為50.00%、42.37%及26.67%。陳培林等[10]研究發(fā)現,在選擇性凍融單囊胚移植周期中,囊胚形成速度對于妊娠結局僅在非優(yōu)質囊胚組中具有影響,表現為D5囊胚移植妊娠結局優(yōu)于D6囊胚移植,而當移植優(yōu)質囊胚時D5與D6囊胚的妊娠結局相當。但是王雪等[11]研究認為D5優(yōu)胚組的臨床妊娠率(60.4% vs. 45.9%)和活產率(42.3% vs. 27.7%)顯著高于D6囊胚(P<0.05)。本研究對囊胚發(fā)育速度進一步細分后發(fā)現,D5上午優(yōu)質囊胚移植的妊娠結局優(yōu)于D5下午囊胚,D5下午囊胚優(yōu)于D6囊胚,與王雪等[11]的研究結果相似。考慮可能由于不同研究之間樣本量的差異和囊胚形成時間及囊胚評級未進一步細分導致結果存在差異。

近年來,除了使用形態(tài)學標準選擇胚胎外,還可以通過胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening,PGS)來評估胚胎質量。一些研究分析了D5和D6的整倍體囊胚,其種植率和活產率并無顯著差異[12-13]。但是也有觀點認為,除了整倍體的評估外,胚胎發(fā)育到囊胚階段的速度和囊胚形態(tài)的評估也是選擇最佳胚胎的關鍵[14]。可能D5和D6囊胚之間的其他代謝或表觀遺傳學差異會進一步對臨床結局造成影響。有研究發(fā)現胚胎發(fā)育速度的遲緩與囊胚的非整倍體有關系,D6胚胎發(fā)育延遲,非整倍體率更高[15]。這可以進一步解釋同等發(fā)育級別不同發(fā)育速度的囊胚移植在臨床妊娠結局上的差異。一些導致胚胎非整倍體的因素,如線粒體或基因表達缺陷、線粒體DNA含量低、紡錘體異常等,均會導致胚胎發(fā)育速度緩慢[16]。在本研究中隨著發(fā)育天數的延長,D6同等級別囊胚的流產率高于D5上午和D5下午囊胚,這造成了D6囊胚活產率的進一步下降。分析其原因可能與發(fā)育速度遲緩囊胚的非整倍體比例增高有關。但是需要考慮到由于本中心D5上午和D5下午均進行囊胚冷凍,導致D6囊胚組中優(yōu)質囊胚比例過低,可能會導致數據統(tǒng)計上的偏倚。

總之,囊胚發(fā)育速度可能是評估囊胚質量的重要指標,發(fā)育速度越快的囊胚其發(fā)育為優(yōu)質囊胚的可能性越大。臨床上進行囊胚篩選時應結合胚胎發(fā)育速度和胚胎形態(tài)學評分進行選擇。建議優(yōu)先選擇D5頂級囊胚或者優(yōu)質囊胚進行移植,可以有效提高活產率。同等形態(tài)學評分的囊胚發(fā)育速度越快其臨床結局越好。如果沒有D5優(yōu)質囊胚,但是有D6優(yōu)質囊胚時需要謹慎考慮移植策略,建議結合卵裂期胚胎發(fā)育速度和形態(tài)慎重選擇。