自噬相關基因的表達量化及其對腎透明細胞癌的預后價值分析

伍艷婷,舒文瑩,王艷平,周毅,簡曉順

在全球大多數國家,惡性腫瘤是導致死亡的主要原因[1],迄今為止,惡性腫瘤還沒有絕對的治愈方法。腎細胞癌是泌尿系統最常見的腫瘤之一,具有隱匿性,對放化療不敏感。其中腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)是腎細胞癌最常見的亞型,占70%～75%,易發生轉移[2]。針對多種激酶和雷帕霉素靶點的抑制劑可提高KIRC的總體存活率,但治療反應因個體而異,大多數患者最終會產生耐藥性[3]。因此,探索分析對個體化治療或臨床診斷有意義的生物標志物,對KIRC的早期診斷和提高生存率十分重要。

自噬在腫瘤的發生、耐藥性、微環境相互作用等多個過程中發揮著至關重要的作用。自噬的發生是一個復雜的多步驟過程,受一系列自噬相關基因的嚴格控制,既可以抑制腫瘤的進展亦能促進腫瘤的進展[4],惡性腫瘤可以誘導微環境的非腫瘤細胞自噬,從而進一步促進腫瘤的生長和進展[5]。自噬相關的化療耐藥性是癌癥治療的一大挑戰。目前,自噬相關基因在多藥耐藥中的作用越來越受重視,研究發現,自噬基因有望成為癌癥的治療靶點[6-8]。

但由于傳統研究的局限性,大多集中在單基因對腫瘤影響的研究上,很少使用大規模基因表達隊列研究自噬與KIRC預后的關系。近年來,隨著自噬在腫瘤中的作用不斷被研究,研究人員發現自噬相關基因可以作為預后生物標志物并成為潛在的治療靶點[9]。為了更好地探索自噬相關基因對臨床預后的影響,利用大型公共數據庫篩選和驗證KIRC自噬相關預后標志物已成為基礎研究的重要補充和發展趨勢。

本研究通過構建一個新的預后模型用于預測KIRC患者的總生存期(OS),并探索了由該模型基因定義的獨特分子特征,包括免疫浸潤和潛在的藥物靶點。這為KIRC預后、免疫治療和藥物敏感性評價提供了一種新的思路和方法,報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據收集 從UCSC xena數據庫(https://xenabrowser.net/datapages/)下載24種常見癌種的表達數據log2(FPKM+1)(FPKM:每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的fragments)、表型數據和生存數據,通過R軟件4.1.2將其表達數據轉換為TPM(每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的Transcripts)數據;從人類自噬數據庫(http://autophagy.lu/)中下載222個自噬相關基因,于GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中做與24種常見癌種的生存分析,最終得到159個與癌癥預后相關的自噬相關基因(ARGs)。

1.2 自噬基因集在癌癥中的表達情況 使用R包“GSVA”進行單樣本基因集富集分析(ssGSEA)得到自噬評分(autophagy score)以量化ARGs在24種癌癥中的表達水平,Kruskal-Wallis分析各癌癥間的表達是否存在差異;Mann-WhitneyU檢驗評估23種癌癥的腫瘤樣本與正常樣本間的差異[其中腎上腺皮質癌(ACC)無正常樣本,故未納入后面的分析];以自噬評分的中位數來定義高評分組與低評分組。

1.3 篩選KIRC差異表達基因 使用“edgeR”包比較KIRC患者的腫瘤樣本和正常樣本的基因表達差異(來自UCSC xena數據庫的counts數據),篩選條件為|logFC|> 1,錯誤發現率(FDR)<0.05。

1.4 預后模型的構建 將531例KIRC患者數據隨機分為訓練集354個(占總KIRC數據的2/3)和測試集177個(占總KIRC數據的1/3);將159個ARGs與KIRC的差異表達基因取交集得到差異表達自噬相關基因(DEARGs);對訓練集進行逐步回歸分析、LASSO回歸分析確定最終模型基因,根據多因素Cox回歸分析的回歸系數和基因的表達量,建立風險預后模型,建立預后模型公式為:風險評分(risk score)=∑(基因表達量×回歸系數),測試集用于驗證其預后能力。

1.5 預后模型的評估和驗證 根據預后模型公式計算風險評分,以風險評分的中位數來定義高風險組和低風險組。繪制生存曲線和受試者工作特征曲線(ROC),并計算曲線下面積(AUC)以評估模型的特異度和敏感度。根據風險評分值進行排序,分布曲線、散點圖和熱圖顯示不同風險組的風險評分分布,患者生存狀態及模型基因的表達情況。將風險評分與腫瘤大小(T)、淋巴結轉移(N)、遠處轉移(M)、種族(Race)、年齡(Age)、性別(Sex)、臨床分期(Stage)、病理分級(Grade)做單因素和多因素Cox回歸分析,確定預后的獨立影響因素。列線圖、ROC曲線預測患者1、3、5年的生存率,并對臨床特征進行分層做生存曲線分析,以進一步分析風險評分的臨床潛力。

1.6 預后模型基因的表達驗證 使用HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org/)驗證模型基因在腫瘤組織和正常組織中的蛋白表達是否與差異表達分析的結果一致。

1.7 免疫細胞浸潤分析 使用CIBERSORT計算免疫細胞在每個KIRC患者中的浸潤情況。每種免疫細胞類型的總比例等于1。Mann-WhitneyU檢驗比較高低風險組患者免疫細胞的浸潤差異情況。

1.8 藥物敏感性分析 從CellMiner數據庫(http://discover.nci.nih.gov/cellminer/)中下載NCI-60 細胞系的RNA表達數據和藥物分析數據,選取經過臨床試驗和FDA批準的792個藥物結果。提取模型基因的表達數據,計算藥物敏感性(IC50),并進行Pearson相關性分析,最終得到每個模型基因的表達與藥物敏感性之間的相關性。以P<0.01對分析結果進行篩選。

1.9 統計學分析 使用R軟件4.1.2對數據進行統計分析和結果可視化。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 ARGs在癌癥中的表達差異情況 ssGSEA結果顯示, ARGs在KIRC中表達最高,腎嫌色細胞癌(KICH)中表達最低(圖1A)。Mann-WhitneyU檢驗結果發現,ARGs在14種癌癥的腫瘤樣本與正常樣本之間表達存在差異(圖1B),其中ARGs在多形性成膠質細胞瘤(GBM)、KIRC、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)和甲狀腺癌(THCA)的腫瘤樣本中表達水平高于正常樣本,在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、結腸癌(COAD)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、肝細胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)的腫瘤樣本中表達水平低于正常樣本(圖1C),而在宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、食管癌(ESCA)、KICH、胰腺癌(PAAD)、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG)、肉瘤(SARC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、胸腺癌(THYM)、子宮內膜癌(UCEC)中表達無差異性。對有差異表達的癌種進行單因素Cox回歸分析,發現自噬評分與KIRC、LUSC的OS相關(圖1D)。

注:A.ARGs在各癌癥中的自噬評分;B.正常樣本與腫瘤樣本之間自噬評分存在差異的癌癥;C.正常樣本與腫瘤樣本自噬評分的中位數;D.單因素Cox回歸分析森林圖。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。BLCA.膀胱尿路上皮癌;BRCA.乳腺浸潤癌;COAD.結腸癌;KIRP.腎乳頭狀細胞癌;HNSC.頭頸鱗狀細胞癌;KIRC.腎透明細胞癌;LIHC.肝細胞肝癌;READ.直腸腺癌;LUSC.肺鱗癌;GBM.多形性成膠質細胞瘤;STAD.胃癌;THCA.甲狀腺癌;PRAD.前列腺癌;LUAD.肺腺癌。

2.2 自噬評分對KIRC患者預后的影響 生存曲線分析結果顯示,KIRC低評分患者的預后比高評分患者差(P=0.039)(圖2A),LUSC高評分患者的預后比低評分患者差(P=0.034)(圖2D),這與已有文獻結果一致[10-11]。單因素、多因素Cox回歸分析結果發現,自噬評分可以作為KIRC患者預后的獨立影響因素(圖2B、2C),但不能作為LUSC患者的獨立預后因素(圖2E、2F)。

注:A.KIRC高低自噬評分組的生存曲線;B、C.影響KIRC預后的單、多因素Cox回歸分析森林圖;D.LUSC高低自噬評分組的生存曲線;E、F.影響LUSC預后的單、多因素Cox回歸分析森林圖。

2.3 確定KIRC差異表達的自噬相關基因并構建預后模型 KIRC的正常樣本與腫瘤樣本差異表達分析結果得到9 632個差異表達基因,將其與上述ARGs取交集,得到35個DEARGs(圖3A)。其中有6個基因在腫瘤組織中下調,29個基因在腫瘤組織中上調(圖3B)。對DEARGs進行逐步回歸分析、LASSO回歸分析,最終確定4個模型基因:BAG1、BIRC5、BNIP3、EIF4EBP1。基于多因素Cox回歸分析結果(表1)構建預后模型,發現BIRC5和EIF4EBP1是高風險基因(HR>1),而BAG1和BNIP3是低風險基因(HR<1)。風險評分=(-0.037)×BAG1表達量+0.021×BIRC5表達量+(-0.003)×BNIP3表達量+0.003×EIF4EBP1表達量。免疫組化結果表明,與正常組織相比,KIRC組織中的BAG1(HPA018121)、BIRC5(HPA002830)、BNIP3(HPA003015)和EIF4EBP1(CAB005032)的蛋白水平上調(圖3C),除BAG1外,其他3個基因的蛋白表達與DEARGs的表達結果一致。

注:A.差異表達基因與自噬相關基因維恩圖;B.35個差異表達自噬相關基因熱圖;C.正常組織和腫瘤組織4個模型基因的蛋白水平比較。

表1 多因素Cox回歸分析預后模型基因對預后的影響

2.4 模型對KIRC患者的臨床預后價值 生存曲線結果顯示,高風險組患者的預后比低風險組患者差(訓練集P<0.001,AUC=0.755,見圖4A、4B;測試集P<0.001,AUC=0.695,見圖4C、4D)。風險因子關聯圖結果顯示,風險評分值越高,患者死亡數越多,訓練集(圖4E)與測試集(圖4F)結果基本一致。其中熱圖顯示,BIRC5和EIF4EBP1在高風險組中上調,是危險因素,而BAG1和BNIP3在高風險組中下調,是有利因素,與多因素Cox回歸結果一致。

注:A、B.訓練集生存曲線和ROC曲線;C、D.測試集生存曲線和ROC曲線;E、F.訓練集和測試集風險因子關聯圖,分布曲線(上)、散點圖(中)和熱圖(下)。

單因素和多因素Cox回歸分析結果發現,構建的模型風險評分、M分期和N分期均可作為KIRC患者預后的獨立影響因素(P<0.05)(圖5A、5B)。為了更好地預測KIRC患者1、3、5年的生存率,構建了列線圖(圖5C)并繪制ROC曲線,AUC分別為0.743、0.740、0.699(圖5D)。為了進一步研究風險評分的臨床預后潛力,基于臨床特征(TNM分期、臨床分期、腫瘤分級)進行生存曲線分析,發現風險評分似乎更適合用于預測臨床分期、腫瘤分級、T期、M0期和N0期的總生存時間,除M1、N1期外,高風險評分患者的預后均比低風險評分患者差(P<0.05)(圖5E)。

注:A、B.單因素、多因素Cox回歸分析森林圖;C、D.列線圖和ROC曲線;E.生存曲線。

2.5 高低風險組免疫細胞浸潤情況比較 基于自噬與免疫細胞浸潤的相關性,計算了每個樣本中腫瘤免疫微環境22種免疫細胞的浸潤情況(圖6A),評估了不同風險組中免疫微環境的組成。與低風險組比較,高風險組中CD8+T細胞、輔助性濾泡T細胞、調節性T細胞和M0巨噬細胞等比例顯著升高,而靜息殺傷細胞、單核細胞和靜息肥大細胞等比例顯著降低(圖6B、C)。

注:A.KIRC患者22種免疫細胞浸潤比例;B、C.訓練集、測試集高低風險組免疫細胞浸潤差異。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

2.6 模型基因的表達與多種藥物敏感性的關系 表2顯示每個基因與藥物敏感性(IC50)最相關的前4個結果。在60個癌細胞系中BAG1與白屈菜紅堿、AM-5992、7-羥基星形孢菌素呈正相關,與INK-128(mTOR抑制劑)呈負相關;BIRC5與SNS-314(極光激酶抑制劑)、5-氟脫氧尿苷10、博來霉素呈正相關,與司美替尼呈反比;BNIP3與P-529(mTOR抑制劑)、特拉替尼、IDH-C227(IDH1R132H抑制劑)呈正相關,與AM-5992呈負相關;EIF4EBP1與SNS-314、氟尿苷、奎扎替尼、維甲酰酚胺呈正相關。

表2 基因表達與藥物敏感性的相關性

在8個腎癌細胞系中BAG1與丁硫氨酸—亞砜亞胺、PF-2771(CENP-E抑制劑)、三氧化二砷呈負相關,與帕博西尼呈正相關;BIRC5與恩曲替尼、Gandotinib(JAK2抑制劑)、AMD-070(CXCR4選擇性抑制劑)、替沃扎尼呈負相關;BNIP3與Saridegib(Smo 特異性抑制劑)、阿扎胞苷、卡鉑呈正相關,與CH-5132799(PI3K抑制劑)呈負相關;EIF4EBP1與AZD-5363、GSK-2141795、Afuresertib、Ipatasertib(AKT抑制劑)呈負相關,見表2。

3 討 論

目前,盡管有大量研究表明自噬參與了KIRC的惡性進展,但以往的研究中僅探索了單個自噬相關基因與KIRC之間的相關性[12-16],缺乏對自噬相關基因在各癌癥中的表達分析,且與多種癌癥預后相關的自噬相關基因與KIRC患者預后之間的相關性尚未明確。雖然目前有文獻報道了自噬相關基因對KIRC患者預后的影響[17-19],但涉及的基因多,臨床經濟實用性欠缺,且未曾發現有相關研究解釋上述所有4個基因在KIRC中的預后價值。在本研究中,筆者發現自噬相關基因在不同癌癥中的表達存在差異,其中在KIRC患者中表達最高。因此構建了由BAG1、BIRC5、BNIP3和EIF4EBP1組成的風險預后模型。發現在KIRC患者中BAG1和BNIP3是低風險基因,其表達越高,患者風險值越低;BIRC5和EIF4EBP1屬于高風險基因,其表達越高,患者風險值越高。風險評分、M分期、N分期可以作為KIRC患者的獨立預后因素。

腫瘤微環境中包含各種細胞,其中浸潤性免疫細胞占很大比例且特定細胞對患者的生存有重大影響[20]。例如,腫瘤相關的巨噬細胞可通過多種方式幫助腫瘤細胞發生免疫逃逸、腫瘤血管生成和轉移[21-23]。上述免疫浸潤分析結果表明,與低風險組比較,高風險組中CD8+T細胞、輔助性濾泡T細胞、調節性T細胞和M0巨噬細胞浸潤比例升高。高風險組的評分與患者預后呈反比,提示這些免疫細胞浸潤增加可能與KIRC患者的不良預后有關。而靜息殺傷細胞、單核細胞和靜息肥大細胞在高風險組中浸潤比例降低,說明這些免疫細胞的浸潤增加可能與KIRC患者的良好預后有關。

近年來,自噬相關基因在多藥耐藥中的作用受到越來越多的關注。以往研究報道,在乳腺癌、結腸癌和卵巢癌細胞系中,星形孢菌素可以通過介導自噬蛋白p62的表達來逆轉順鉑的耐藥性[24],說明可以通過改變自噬水平或抑制自噬相關基因的表達,在一定程度上提高藥效,從而為臨床用藥提供理論依據[25]。在本研究中構建的4個模型基因分別與多種癌細胞系的藥物敏感性相關,其中在腎癌細胞系中,與BAG1表達呈正相關的藥物2個,負相關的11個;與BIRC5表達呈正相關的3個,負相關的51個;與BNIP3表達呈正相關的3個,負相關的1個;與EIF4EBP1表達呈正相關的4個,負相關的21個。且相關系數可達到0.9以上。這可能為腎癌的預后提供潛在的藥物治療靶點,但仍需要更多的試驗加以驗證,以評估該模型基因對臨床試驗中新藥的影響,為新藥篩選提供選擇。

綜上所述,在本研究中,筆者從分析預后自噬相關基因在泛癌中的表達差異,聚焦到對KIRC患者的生存預后分析,確定了一種由4個差異自噬基因(BAG1、BIRC5、BNIP3和EIF4EBP1)組成的新預后標志物模型,同時證明了該模型與KIRC 患者的OS獨立相關,并發現其在腫瘤免疫微環境、藥物敏感性等方面也具有重要意義。但潛在的分子機制還需要進一步的實驗研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

伍艷婷:提出研究方案并設計課題,實施研究過程,論文撰寫;舒文瑩:確定分析方法,論文修改;王艷平:文獻調研,資料搜集和數據整理;周毅:課題設計審核;簡曉順:提出研究思路,論文審核