基于NCOA4介導的鐵自噬探討大補脾湯對放射性肺損傷大鼠氧化應激的影響

張朝寧 ，張志明 ，余臣祖

1.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省中西醫結合腫瘤臨床醫學研究中心，甘肅 蘭州 730020

放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部惡性腫瘤放療最常見和最致命的并發癥之一，發生率約15%[1]。RILI是限制放療有效劑量的主要因素，嚴重影響放療方案的順利實施和治療效果。RILI分為2個階段，早期表現為滲出性炎癥反應，即放射性肺炎，若繼續惡化則在中晚期表現為放射性肺纖維化[2]。氧化應激是RILI的主要原因，放療產生的活性氧（ROS）貫穿病程始終，對放射性肺炎和肺纖維化都有促進作用，因而抗氧化對RILI 治療具有重要意義[3]。

近年研究顯示，鐵死亡也參與RILI發生過程[4]，鐵死亡是Dixon等[5]發現的細胞死亡方式，以毒性脂質過氧化物累積所致氧化代謝失衡為特征。細胞內鐵超載是鐵死亡發生的基礎，而過多的活性鐵可由鐵自噬產生。鐵自噬是依賴核受體輔激活因子4（NCOA4）的新型自噬類型，鐵自噬啟動后，鐵蛋白被輸送到自噬小體，與溶酶體融合后降解為游離鐵離子，通過芬頓反應產生大量ROS，導致鐵死亡發生[6]。因此，抑制鐵自噬調控鐵死亡可能減輕氧化應激反應，為RILI防護提供新思路。

大補脾湯出自敦煌醫學卷子《輔行訣臟腑用藥法要》，有補益脾肺、益氣滋陰之效。研究發現，大補脾湯對RILI有一定保護作用[7-8]。本實驗基于NCOA4介導的鐵自噬調控鐵死亡探討大補脾湯對RILI大鼠的抗氧化作用及作用機制，為RILI防護提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

健康SPF級雄性SD大鼠30只，2～3月齡，體質量180～220 g，蘭州大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2018-0002。飼養于蘭州大學實驗動物中心SPF 級實驗室，溫度20～25 ℃、相對濕度40%～70%，使用許可證號SYXK（甘）2018-0005。

1.2 藥物及制備

大補脾湯（人參、炙甘草、干姜各15 g，白術、麥冬、五味子、旋覆花各5 g），飲片購自甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥房。由甘肅中醫藥大學中藥制藥實驗室按傳統煎藥法煎煮2次，合并藥液，以100目濾布過濾，濾液經旋轉、蒸發、濃縮，按人與大鼠體表面積折算，配制成含原藥材1.214 g/mL藥液。參考前期研究基礎[7]，按照上述藥液濃度的0.5、2倍，再分別配制成0.607、2.428 g/mL藥液，分裝，4 ℃冷藏備用。

1.3 試劑

谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所，貨號分別為A005-1-2、A001-1-2、A003-1-2；亞鐵離子（Fe2+）檢測試劑盒，北京索萊寶生物工程有限公司，貨號20 220014；ROS試劑盒，上海貝博生物科技有限公司，貨號BB-470515-100T；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、NCOA4、核因子E2 相關因子2（Nrf2）抗體，英國艾博抗公司，批號分別為A1933、A1956、A1375；鐵蛋白重鏈1（FTH1）抗體，Immunoway公司，貨號YT1692；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液，北京索萊寶科技有限公司，貨號分別為20210419、20 210911；電泳Marker、ECL發光液、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒、TRIeasy，上海翊圣生物科技有限公司，貨號分別為26616、36208-A/B、11141-C、11202ES08、10606ES60。

1.4 儀器

X射線輻射儀（美國Faxitron公司，型號RX650），包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），組織攤片機（金華科迪儀器設備有限公司，型號KD-P），顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號BX43+sc50），組織勻漿器（美國Bio-Gen公司，型號PRO200），電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6D），實時定量PCR 儀（美國Thermo 公司，型號StepOne Plus），轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6D），NanoDrop核酸濃度測量儀（美國Thermo公司，型號ND-ONE-W），酶標儀（美國Bio-Rad 公司，型號iMark），恒溫培養箱（澳柯瑪股份有限公司，型號BC/BD-208HNE），高速低溫臺式離心機（德國Eppendorf公司，型號TGL-16）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

采用隨機數字表法將30只大鼠隨機分為正常對照組、模型組和中藥高、中、低劑量組，每組6只。中藥高、中、低劑量組每日分別予大補脾湯藥液2.428、1.214、0.607 g/mL灌胃，灌胃體積10 mL/kg，正常對照組和模型組每日灌胃等量生理鹽水，連續14 d。

2.2 造模

除正常對照組外，其余各組于給藥結束后予X射線單次照射。照射前用無菌生理鹽水配制0.3%戊巴比妥鈉溶液，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠。參考前期研究方法[7-8]，在X射線模擬機下定位，照射野（右肺）2 cm×3 cm，鉛皮屏蔽其余部位，用X射線輻射儀8 MeV 射線單次照射右肺，源皮距200 cm，劑量率1 Gy/min，均勻率96%，照射吸收劑量8 Gy。麻醉及照射過程中大鼠無死亡。

2.3 取材

照射后各組大鼠正常飼養，第7日過量麻醉處死大鼠，取出右肺，冰生理鹽水沖洗，剪成3份：1份肺組織制成勻漿，按試劑盒說明書步驟檢測Fe2+、GSH、MDA、SOD、ROS含量；1份放入相應凍存管，-80 ℃冰箱凍存，用于Western blot和qPCR檢測；剩余肺組織用4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫組化檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 HE染色

將4%多聚甲醛固定的右肺組織取出，經梯度乙醇脫水、石蠟包埋后切片，HE染色，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察右肺組織病理改變。

2.4.2 免疫組化檢測

右肺組織常規石蠟包埋、切片（厚度4 μm），經脫蠟、水化、抗原修復后，封閉，加Nrf2 一抗（1∶200）、NCOA4一抗（1∶300），4 ℃孵育過夜，加二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1 h，DAB顯色，脫水，封片。顯微鏡讀片拍照，陽性染色為肺泡和肺間質出現棕褐色顆粒，Image Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度。

2.4.3 Western blot檢測

取200 mg冷凍肺組織樣本，加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白樣本變性，SDS-PAGE，轉膜，加入FTH1、GPX4一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后加二抗，室溫孵育1 h，化學發光儀中顯影曝光，用Image J圖像分析軟件計算目的蛋白相對表達量（目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值）。

2.4.4 qPCR檢測

采用Trizol法提取右肺組織總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板，進行qPCR。反應體系：qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 1 μL，加無菌超純水至20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，共40個循環。以β-actin為內參，2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物由博邁德生物科技公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統計學方法

4 結果

4.1 大補脾湯對模型大鼠右肺組織病理形態的影響

正常對照組大鼠右肺組織結構清晰，內部結構正常，無充血、纖維化等炎性改變；模型組大鼠肺泡壁斷裂，肺泡塌陷變形，肺間質充血、出血、炎性細胞浸潤并伴有少量纖維化；中藥各劑量組大鼠右肺損傷較模型組減輕，中藥高劑量組肺組織炎性細胞減少，充血、出血減輕，滲出減少，中藥中劑量組少量出血，炎性細胞明顯減少，中藥低劑量組肺泡變形仍較嚴重，炎性細胞數量較多。見圖1。

圖1 各組大鼠右肺組織病理形態（HE染色，×200）

4.2 大補脾湯對模型大鼠右肺組織Fe2+、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶、活性氧含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠右肺組織Fe2+、MDA、ROS含量明顯升高，GSH、SOD含量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組大鼠右肺組織Fe2+、MDA、ROS含量明顯降低，GSH、SOD含量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），其中中藥高劑量組變化更明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠右肺組織Fe2+、GSH、MDA、SOD、ROS含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

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4.3 大補脾湯對模型大鼠右肺組織核因子E2 相關因子2、核受體輔激活因子4、鐵蛋白重鏈1、谷胱甘肽過氧化物酶4蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠右肺組織Nrf2、FTH1、GPX4蛋白表達明顯降低，NCOA4蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組大鼠右肺組織Nrf2、FTH1、GPX4蛋白表達明顯升高，NCOA4蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3、圖2、圖3。

表3 各組大鼠右肺組織Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠右肺組織Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

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4.4 大補脾湯對模型大鼠右肺組織核因子E2 相關因子2、核受體輔激活因子4、鐵蛋白重鏈1、谷胱甘肽過氧化物酶4 mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠右肺組織Nrf2、FTH1、GPX4 mRNA表達明顯降低，NCOA4 mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組大鼠右肺組織Nrf2、FTH1、GPX4 mRNA表達明顯升高，NCOA4表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠右肺組織Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4 mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠右肺組織Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4 mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

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5 討論

肺對輻射較敏感，胸部惡性腫瘤患者接受放療時正常肺組織不可避免被損傷而發生RILI，可能導致治療中斷，影響放療效果。雖然RILI分為2個階段，但臨床中觀察到RILI發病是一個連續過程，2個階段并沒有明確界線。RILI是多種機制綜合調控、多因素相互作用的復雜過程，機制尚未完全闡明，缺乏有效治療措施[9-10]。因此，開發理想的RILI防護藥物對腫瘤臨床放療具有重要意義。

中醫藥具有整體調治、不良反應小等優點，是輻射防護領域的研究熱點。放療后患者正氣大傷，陰陽不和，五臟不安，臨床常見肺脾兩虛或氣陰兩虛等證型。脾屬土，脾土可以生金，肺脾同屬太陰，生理病理上相互影響，治療上亦相輔相成。培土生金法根據中醫學五行相生理論“虛則補其母”原理，通過補益脾氣達到補益肺氣的作用。

大補脾湯主治脾氣大疲、飲食不消、時自吐利、其人枯瘦如柴立不可動轉，口中苦，干渴，汗出，氣急脈微而時微者。方中人參益氣生津，炙甘草、白術健脾益氣，干姜溫中健脾，麥冬益胃生津，五味子斂肺生津，旋覆花降逆止嘔。諸藥合用，共奏益氣生津、補脾益肺之效。切合胸部惡性腫瘤患者因放療射線損傷導致的肺脾氣陰虧虛之病機特點。

氧化應激在RILI中起重要作用，是RILI的主要病理因素，也是RILI發生及病情進展的促進因素[11]。抗氧化損傷是近年來RILI防護研究的主要方向。本實驗通過X射線照射大鼠右肺部建立RILI模型，選取GSH、MDA、SOD、ROS等氧化應激相關指標進行檢測，結果顯示模型組大鼠肺泡壁斷裂，肺泡塌陷變形，肺間質充血、出血、炎性細胞浸潤并伴有少量纖維化，表明RILI模型造模成功；肺組織MDA、ROS含量升高，GSH、SOD含量降低，提示大鼠發生氧化應激反應。大補脾湯可上調GSH、SOD水平，下調MDA、ROS水平，提示大補脾湯可抑制RILI大鼠氧化應激，提高其抗氧化能力，從而減輕肺組織炎性細胞聚集，改善RILI病理損害。

鐵死亡以鐵離子代謝失衡導致細胞內鐵超載為基礎，以GPX4表達降低為標志事件，通過芬頓反應引起毒性脂質過氧化物異常累積，進而對細胞產生氧化損傷[12]。GSH 水平正常時，GPX4 可抑制脂質過氧化，保護細胞不發生鐵死亡，故GPX4活性降低是鐵死亡發生的重要機制之一[13]。研究發現，鐵死亡是RILI發生發展的重要促進因素，鐵死亡誘導劑Erastin通過降低GPX4表達增加脂質過氧化，加快成纖維細胞分化，促進放射性肺纖維化病情進展。相反，鐵死亡抑制劑可上調GPX4表達，抑制脂質過氧化反應及成纖維細胞分化，阻止RILI發展[14-15]。

鐵蛋白是細胞內儲存鐵的蛋白復合物，不僅可以阻止細胞內產生過多的游離Fe2+，還可以在Fe2+水平降低時將儲存的鐵釋放以維持鐵穩態[16]。自噬是細胞在應激狀態下降解代謝產物及細胞器的自我保護過程[17]。Mancias等[18]通過蛋白定量組學鑒定認為，NCOA4介導鐵蛋白通過溶酶體進行降解并釋放游離Fe2+，并把這一過程命名為鐵蛋白自噬。NCOA4水平降低時，鐵自噬水平也降低。鐵自噬使大量游離Fe2+在細胞內聚集，通過芬頓反應產生大量ROS，導致細胞鐵死亡。因此，抑制NCOA4 表達可減少鐵蛋白降解，抑制鐵死亡[19-20]。FTH1是組成鐵蛋白的亞基之一，可調控鐵儲存并維持鐵穩態，FTH1表達升高能抑制鐵死亡，反之鐵蛋白自噬使FTH1降解增加，則會升高鐵水平而促進鐵死亡，加重氧化損傷[21]。

Nrf2是細胞抗氧化損傷的主要因子之一，同時可通過調控下游靶基因GPX4表達參與調節鐵死亡，與鐵離子代謝、脂質過氧化及GSH代謝等鐵死亡的重要環節密切相關[22]。研究發現，敲除Nrf2基因可加重RILI炎癥及氧化損傷，過表達Nrf2則阻礙肺纖維化進展，對RILI有一定保護作用[23]。因此，通過Nrf2/GPX4調控鐵死亡，緩解氧化應激是防護RILI的新靶點。

基于上述理論，推測大補脾湯減輕RILI大鼠氧化應激可能是通過鐵自噬調控鐵死亡，抑制細胞內游離Fe2+產生，進而緩解脂質過氧化反應而實現。選取Fe2+含量，NCOA4、FTH1、GPX4、Nrf2表達作為鐵死亡的檢測指標，結果顯示，中藥各劑量組大鼠右肺組織Fe2+含量、NCOA4表達較模型組降低，Nrf2、FTH1、GPX4表達升高。表明大補脾湯可通過下調NCOA4表達抑制鐵自噬，減少鐵蛋白降解，進而使FTH1表達升高，減少細胞中游離Fe2+釋放，抑制細胞鐵死亡，緩解氧化應激，改善RILI大鼠肺部病理損害，且高劑量大補脾湯效果更顯著。

綜上所述，大補脾湯可能通過抑制NCOA4介導的鐵蛋白自噬，減少活性鐵釋放，減輕RILI肺組織鐵超載，抑制細胞鐵死亡，從而緩解RILI氧化應激，改善病理損害，發揮對RILI的防護作用。