基于均勻設計法探討益氣溫陽活血利水中藥組分防治慢性心力衰竭的劑量配比

韓楊楊 ，韓玉潔 ，王海娟 ，高凡 ，劉興超， ，郭秋紅，

1.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050200； 2.河北省中藥組方制劑技術創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200；3.河北省高校中藥組方制劑應用技術研發(fā)中心，河北 石家莊 050200

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于長期多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和/或功能的異常改變，使心臟收縮和/或舒張能力減弱，從而引起的一組復雜臨床綜合征，是心臟疾病發(fā)展的終末階段[1]。近年來，中醫(yī)藥防治CHF取得了較好的療效，中藥不良反應相對較小、安全劑量范圍大，配伍治療可增強療效[2]。

課題組前期研究認為，CHF為本虛標實之證，以宗氣虧虛為本，血瘀、痰濁、水飲為標，基本病機為氣虛、陽虛、血瘀、水停，故以益氣溫陽、活血利水法為治療核心，臨床及實驗研究均顯示療效良好[3-5]。通過文獻檢索收集防治CHF的中藥復方，具有益氣溫陽活血利水作用且出現(xiàn)頻次≥15的中藥為黃芪、桂枝、丹參、葶藶子[6]，網(wǎng)絡藥理學研究初步闡明其有效組分配伍治療CHF的可能作用機制[7]。目前，益氣溫陽活血利水中藥治療CHF組方的劑量配比還處于探索階段。因此，本研究采用主動脈弓縮窄法制備CHF大鼠模型，運用均勻設計法探討防治CHF中藥益氣、溫陽、活血、利水組分最佳配比，為中藥組分配伍規(guī)律研究提供參考。

1 動物、儀器與試藥

SPF 級雄性SD 大鼠120 只，4～8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006，動物合格證號110011200110846981。飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學院SPF級實驗動物中心，自由攝食飲水，12 h/12 h明暗交替，溫度20～22 ℃，濕度50%～60%，隔日更換墊料。本實驗已通過河北中醫(yī)學院實驗動物管理倫理委員會審查批準（DWLL2021039）。

Vevo2100 小動物超聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司），SH-2型加熱磁力攪拌器（天津市泰斯特儀器有限公司），1-15K型高速冷凍離心機（美國Sigma 公司），HT7700 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

黃芪總皂苷（含黃芪甲苷50%，批號K20495）、丹參總酚酸（含丹酚酸B 50%，批號K20386），西安開來生物科技有限公司；葶藶子水提物（按10∶1比例提取，批號FY20Y1112）、桂皮醛（含桂皮醛98%，批號FY21S0108），南通飛宇生物科技有限公司。實驗時以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液為溶劑將4種組分藥物混合按實驗用量加入，制成所需濃度的混懸液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。卡托普利片（25 mg/片，批號393200204），石藥集團歐意藥業(yè)有限公司。將卡托普利片研磨后，用100 ℃蒸餾水和0.5%羧甲基纖維素鈉配制成1.05 mg/mL藥液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

N端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，貨號F15151）；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）試劑盒（北京北方生物技術研究所有限公司，貨號D02PZB）；醛固酮（ALD）試劑盒（北京北方生物技術研究所有限公司，貨號D03PZB）；肌鈣蛋白T（cTnT）試劑盒（生工BBI生命科學有限公司，貨號D731143）。

2 方法與結(jié)果

2.1 造模

采用主動脈弓縮窄術誘導CHF大鼠模型[8]。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術臺，左胸備皮并用碘伏消毒，鈍性分離左胸腔第一肋間隙靠近第二肋上緣逐層打開，暴露胸腺后將胸腺推至頭側(cè)尋找主動脈弓，主動脈弓呈“H”型，將注射針頭去尖并將起始大約0.5 cm彎折30°制成特制挑針，將4-0號非吸收獸用縫合線穿進特制挑針中，使用特制挑針找到主動脈弓頭臂干與左頸總動脈的連接處，將墊針與主動脈弓結(jié)扎后，緩慢取出墊針。擦拭淤血后，迅速逐層縫合傷口。造模4周后檢測大鼠射血分數(shù)（EF）進行評估，以EF≤50%判斷造模成功。假手術組只做開胸處理。

2.2 均勻設計方案

采用U8（85）均勻設計表，以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、桂皮醛和葶藶子水提物為考察因子，每個因子取8個水平。通過查閱文獻確定各藥物的劑量范圍，分別為黃芪總皂苷20～60 mg/kg[9-10]、丹參總酚酸10～40 mg/kg[11-12]、葶藶子水提物50～190 mg/kg[13-14]、桂皮醛30～100 mg/kg[15-16]。根據(jù)均勻設計表設計各組給藥劑量，得到均勻設計方案，見表1。

表1 益氣溫陽活血利水中藥組分配伍均勻設計方案（mg/kg）

2.3 均勻設計篩選實驗

2.3.1 分組、給藥及取材

80只大鼠按體質(zhì)量隨機分為假手術組、模型組、不同劑量組分配伍組（均勻1～8組），每組8只。成模后，均勻1～8組按均勻設計方案分別予4種組分藥物混懸液灌胃，給藥體積1 mL/100 g，假手術組、模型組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)8周。末次灌胃1 h后，使用小動物超聲成像系統(tǒng)檢測大鼠心功能指標；禁食禁水12 h，3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）麻醉大鼠，股動脈取血，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，分離血清后冷藏，用于檢測生化指標；剖取左心室部分組織，用4%多聚甲醛固定，用于觀察心肌組織病理形態(tài)。

2.3.2 均勻設計各組對大鼠心功能的影響

大鼠吸入異氟烷（1%氧氣+5%異氟烷）進行麻醉，腹部向上固定于操作臺上，心前區(qū)備皮，將小動物超聲成像系統(tǒng)探頭置于大鼠胸前，以胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面，檢測心功能指標，包括EF、短軸縮短率（FS）、收縮期左室前壁厚度（LVAWs）、舒張期左室前壁厚度（LVAWd）、收縮期左室后壁厚度（LVPWs）、舒張期左室后壁厚度（LVPWd），連續(xù)檢測3次，取平均值。

與假手術組比較，模型組大鼠EF、FS均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組EF、FS均升高（P＜0.01）。與假手術組比較，模型組大鼠LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均減小（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較（±s，每組8只）

表2 各組大鼠心功能指標比較（±s，每組8只）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.3.3 均勻設計各組對大鼠血清N 端腦利鈉肽前體含量的影響

全自動生化分析儀檢測血清NT-proBNP含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。與假手術組比較，模型組大鼠血清NT-proBNP含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，除均勻3組外，各給藥組大鼠血清NT-proBNP含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清NT-proBNP含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清NT-proBNP含量比較（±s，pg/mL）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.4 最佳配比分析

采用SPSS19.0 軟件，分別以NT-proBNP、EF 為因變量，黃芪總皂苷（Xa）、丹參總酚酸（Xb）、葶藶子水提物（Xc）和桂皮醛（Xd）為自變量，進行多元線性回歸分析。NT-proBNP 回歸方程為Y=374.439-0.01Xa+0.048Xb-0.01Xc-0.001Xd，EF 回歸方程為Y=42.942+0.03Xa-0.013Xb+0.001Xc+0.003Xd。 最佳配比為黃芪總皂苷60 mg/kg，丹參總酚酸10 mg/kg，葶藶子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg。

2.5 驗證實驗

2.5.1 分組與給藥

將40只大鼠按體質(zhì)量隨機分為假手術組、模型組、組分配伍優(yōu)選組（HDTG 組，黃芪總皂苷60 mg/kg，丹參總酚酸10 mg/kg，葶藶子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg）、陽性藥組（卡托普利10.5 mg/kg），每組10只。造模4周后，給藥組給予相應藥物灌胃，假手術組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)8周。

2.5.2 優(yōu)選組分配伍對大鼠心重指數(shù)的影響

大鼠股動脈取血后，迅速剖離心臟組織，預冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱量心臟質(zhì)量。心重指數(shù)（%）=全心質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。

與假手術組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、心重指數(shù)均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組體質(zhì)量無明顯差異，HDTG組和陽性藥組全心質(zhì)量、心重指數(shù)明顯減小（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、心重指數(shù)比較（±s）

表4 各組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、心重指數(shù)比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.5.3 優(yōu)選組分配伍對大鼠血漿血管緊張素Ⅱ、醛固酮及血清肌鈣蛋白T含量的影響

使用半自動生化分析儀檢測血漿AngⅡ、ALD及血清cTnT含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

與假手術組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ、ALD和血清cTnT含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，HDTG 組和陽性藥組大鼠血漿AngⅡ、ALD 和血清cTnT含量均降低（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠血漿AngⅡ、ALD及血清cTnT含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠血漿AngⅡ、ALD及血清cTnT含量比較（±s，pg/mL）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較， ##P＜0.01

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2.5.4 優(yōu)選組分配伍對大鼠心肌組織形態(tài)的影響

將4%多聚甲醛固定的心肌組織取出，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，分別進行HE、Masson染色，光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)。

假手術組大鼠心肌染色均勻，肌橫紋排列整齊，細胞間界限均勻清晰，細胞核形態(tài)完整；模型組染色不均勻，心肌橫紋明顯斷裂，細胞水腫明顯，心肌纖維增粗、斷裂，炎性細胞浸潤及成纖維細胞增生明顯，細胞排列紊亂、間隙增寬，核溶解；HDTG組和陽性藥組均顯著緩解，心肌細胞水腫及炎性細胞浸潤減少，心肌細胞排列較整齊，成纖維細胞增生改善。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)（HE染色，×400）

與假手術組比較，模型組病理切片心肌細胞排列雜亂，出現(xiàn)大量藍紫色膠原纖維明顯堆積，心肌結(jié)構(gòu)被破壞；與模型組比較，HDTG組和陽性藥組心肌細胞排列較整齊，膠原纖維堆積情況減少。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)（Masson染色，×400）

3 討論

根據(jù)CHF臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學“懸飲”“水腫”“喘證”“心脹”等范疇[17]，病位在心臟及血脈，與肺、脾、肝、腎等臟相關[18]，主要表現(xiàn)為勞力性呼吸困難、夜間陣發(fā)性呼吸困難、下肢水腫、咳嗽、食欲不振等。CHF的核心病機是虛、瘀、水，主要治法為益氣溫陽、活血利水[19]。益氣藥有明顯強心作用，與溫陽藥配伍可使療效更為顯著；兼以去除標實，采用活血利水法使瘀血得消，水濕得化。黃芪總皂苷能改善心力衰竭大鼠心功能，延緩左室重構(gòu)[20]。葶藶子水提液可改善心力衰竭大鼠心臟功能，抑制心室重構(gòu)，減少心肌細胞凋亡[13]。丹參總酚酸改善心肌細胞內(nèi)鈣循環(huán)，增強心肌舒張和收縮功能[11]。桂皮醛可降低高血壓小鼠血壓，抑制血管重塑和炎癥反應[21]。

NT-proBNP對于診斷和鑒別心力衰竭具有良好的特異性和敏感性。NT-proBNP水平與心力衰竭的嚴重程度呈正相關，為心力衰竭常用的診斷指標[22-24]。心臟超聲是目前臨床診斷心血管疾病及療效評定的重要手段，其中左心室EF隨心功能分級升高而降低，臨床常作為評估左心室重構(gòu)的重要參考指標[25]。NT-proBNP和EF可分別在CHF血液及心臟功能上反映心力衰竭的嚴重程度，故選擇作為因變量。

本研究基于均勻設計法，制備大鼠CHF模型，以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、葶藶子水提物、桂皮醛4種中藥組分為觀察對象，大鼠血清NT-proBNP含量及EF為因變量，通過多元回歸分析得到該組方的最佳配比：黃芪總皂苷60 mg/kg，丹參總酚酸10 mg/kg，葶藶子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg。該配比中丹參總酚酸劑量較小。無論中醫(yī)病程中的血瘀，還是現(xiàn)代醫(yī)學中由左心衰竭引起右心衰竭導致體循環(huán)淤血，在疾病發(fā)展階段中都屬于晚期，故發(fā)揮活血化瘀功效的丹參總酚酸與藥效為負相關，考慮與疾病進程有關。驗證實驗表明該配比有效。本研究結(jié)果表明，益氣溫陽活血利水中藥組分對CHF有較好治療效果，且有一定配比規(guī)律，可為中藥組分配伍臨床應用提供參考。