HIV-1免疫印跡試驗不確定/陰性樣本病毒載量檢測結果分析

李梅 袁薇,△ 楊敬源 劉勇

(1.貴州醫科大學,貴州 貴陽 550025;2.貴州省臨床檢驗中心,貴州 貴陽 550002)

免疫印跡蛋白法(western blot,WB)是診斷艾滋病感染的確證試驗之一[1],但由于急性期/早期HIV感染者處于窗口期其體內抗體滴度較低、晚期艾滋病患者消耗了大量抗體、老年人免疫失衡產生交叉性抗體等原因[2-3],容易出現抗體不確定的結果,導致WB不確定樣本的感染者診斷被延遲。病毒載量(Viral Load,VL)試驗具有高靈敏性和高特異性,檢測結果窗口期短于WB,適用于初篩有反應性,WB抗體不確定/無特異性條帶及流行病學史有意義的樣本檢測,其結果已經被作為HIV感染的診斷依據之一[4]。本研究對HIV-1抗體不確定/陰性樣本補充VL檢測,為及時診斷HIV感染提供參考。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年1月-5月貴州省2個市(州)初篩實驗室抗體篩查有反應性的血清樣本,經貴州省臨床檢驗中心艾滋病確證實驗室進行WB,診斷為HIV-1抗體不確定樣本進行HIV-1核酸定量實驗檢測,并收集樣本個案信息,包括年齡,性別等。本研究通過貴州省臨床檢驗中心倫理委員會批準(編號:2021001)。

1.2研究方法

1.2.1HIV-1抗體補充試驗 免疫印跡蛋白法(WB):儀器為瑞士Te Can免疫印跡儀、德國CY blot蛋白印跡儀、英國Bee Blot48全自動免疫印跡儀。試劑盒來源于上海英旻泰(IMT)生物技術有限公司和德國麥克萊金公司生產的人類免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗體確證試劑。

1.2.2HIV-1VL檢測 使用StreamSP96全自動核酸提取儀和ABI7500擴增儀,人類免疫缺陷病毒(HIV1+2型)核酸提取試劑和擴增試劑均來源于中山大學達安基因股份有限公司。

1.2.3結果判定 實驗結果按照《全國艾滋病檢測技術規范》(2020年修訂版)和試劑盒說明書進行判定,實驗過程嚴格遵守標準操作程序進行,每批次VL試驗均進行室內質量控制,定期參加國家臨床檢驗中心室間質評,結果合格。(1)IMT試劑結果判定:①陰性:無病毒特異性條帶出現;②陽性:有以下兩個或更多的條帶顯著存在:gp160/gp120、gp41、p24,其他的HIV-1蛋白條帶可能出現也可能不出現;③不確定:既不符合陽性條帶模式,又不符合陰性條帶模式標準的任意條帶。(2)麥克萊金試劑結果判定:①陰性:無檢測線≥臨界值、gp120或/和gp105≥臨界值;②陽性:同種HIV類型的兩個ENV檢測線≥臨界值(gp120+gp41或者gp105+gp36)、1個ENV檢測線(僅gp41或者gp36)和至少1個GAG檢測線(p24、p17)或1個POL檢測線(p31、p51)≥臨界值;③不確定:根據條帶結果無法做出陰性或者陽性的判斷。(3)VL最低檢測線為250copies/mL。VL>5 000 copies/mL即可判斷為HIV感染、低于檢測下限和未檢出不能排除HIV感染。

1.3統計學方法 使用Excel2016對數據整理和輸入,實驗結果用SPSS20.0進行統計學分析。檢驗水準α=0.05,單側檢驗,定性資料使用χ2檢驗和Fisher確切概率法,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1WB檢測結果分析 1 440例HIV初篩有反應性的樣本經過WB檢測,HIV抗體陽性1 142例、陰性159例、不確定139例。從性別分布來看,男性初篩陽性有953例,WB確診陽性率85.4%(814/953);女性初篩陽性487例,WB陽性率為66.7%(325/487)。根據樣本信息將年齡分為4組,從年齡分布來看,WB確證陽性的感染者年齡在4～87歲之間,50～75歲之間檢測出HIV感染人數最多,25～50歲年齡組之間次之,小于25歲和大于75歲HIV感染者較少,分別只有53例和76例。<25歲年齡組WB確證陽性率為52.0%低于其他組,但陰性率確明顯高于其余各年齡組,差異有統計學意義(χ2=25.9,P<0.01)。見表1。

表1 不同性別、年齡段初篩陽性樣本的WB確證情況

2.2139例HIV-1抗體不確定帶型及VL值分布情況 139例不確定樣本帶型以p24占50.4%(70/139)、p17占14.4%(20/139)、p24+p17占12.2%(17/139)為主,這3種類型在所有帶型中共占77%(107/139)。對139例抗體不確定樣本進行VL試驗,36例可判定為HIV感染所占比例達25.9%、1例VL<5 000 copies/mL和102例未檢出。36例診斷為HIV感染的不確定帶型分別是:p24占58.3%(21/36)、p24+p17占22.2%(8/36)。102例VL未檢出不確定帶型p24占51.0%(52/102)、P17占19.6%(20/102)。1例低于檢測下限帶型為P24+P17。36例VL>5 000 copies/mL的陽性樣本中,VL高于檢測上限(>1×108copies/mL)2例,86.15%(31/36)的不確定樣本VL值范圍為1×105～1×108copies/mL。不確定樣本中男性出現陽性比例高于女性,差異有統計學意義(χ2=11.4,P<0.01)、以50歲為感染HIV醫學晚年年齡分組,≥50歲以上人群陽性占比高于50歲以下人群(χ2=11.3,P<0.01)。見表2。

表2 139例不確定樣本不同性別,年齡陽性率差異

2.3IMT試劑WB陰性樣本VL分布及VL>5 000 copies/mL樣本使用麥克萊金試劑檢測結果分析 159例WB陰性樣本經VL檢測,有153例(96.2%)VL未檢出,6例(3.8%)VL>5 000 copies/mL,判斷為HIV感染。對這6例樣本使用麥克萊金人類免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗體確證試劑盒進行檢測,有5例樣本條帶判定為陰性、1例樣本gp41檢測值≥臨界值,兩種試劑檢測結果的一致性較好。見表3。

表3 6例IMT陰性樣本使用麥克萊金試劑復核結果判定情況

2.4追蹤139例抗體不確定者的轉歸情況 139例抗體不確定樣本追蹤到22例(15.8%),隨訪時間為2～24周,其中10例VL>5 000 copies/mL 樣本,隨訪后WB檢測結果轉陽;6例VL未檢出樣本,WB結果轉為無特異性條帶;6例VL未檢出樣本,其WB帶型無進展,隨即對這6例樣本再次進行VL檢測,VL值均為未檢出,結合2次WB帶型和2次VL檢測結果、電話回訪詢問其流行病學史等因素分析,最終排除了這6例樣本HIV感染的可能性。

3 討 論

本研究發現,男性HIV陽性檢出率高于女性,該結果與劉建禮研究結果類似[5],也符合貴州省艾滋病疫情流行分布[6],25歲以下人群陽性率低于其他年齡組,陰性率也明顯高于其他年齡組,推測這可能是年輕人更容易到接受健康教育,認識到合理使用安全套有利于預防艾滋病感染,危險性行為后主動尋求檢測有關。本研究中不確定帶型以p24出現的比例較高,這與有關報道一致[7-8],單獨的p24條帶存在于隨訪后WB轉陽的樣本中,提示可能為早期感染的帶型[9],p24在VL未檢出時也會大量出現,推測存在特異性反應[3-4,9],另外專業檢測技術人員判讀條帶習慣也是p24帶型過多的原因之一,因此無法通過p24帶型預測WB不確定樣本的歸轉情況。此外,本研究顯示,WB不確定樣本經VL檢測后,發現50歲及以上人群WB不確定樣本陽性檢出比例高于50歲以下人群,提示年齡可能是影響WB不確定結果的重要因素之一,該結論與黎雅娟研究道相似[10],目前我國老年人艾滋病感染率已經達到1.68%,高于全人群HIV感染率0.058%[11],隨著我國老年人群性觀念逐漸開放,發生危險性行為時更容易引起HIV傳播或感染[12],未來50歲以上老年人群或將成為艾滋病檢測、監控、防治重點人群[13]。因此,為了老年人晚年生存質量有保證,當該人群WB結果為不確定,隨訪時應將該人群作為重點人群加以關注或直接進行VL檢測。

HIV感染人體后,病毒開始大量復制、而抗體的產生需要一定時間[14],在急性感染窗口期未產生足夠抗體或者艾滋病晚期抗體即將消耗殆盡時WB表現出HIV-1抗體不確定結果[15],對不確定樣本可選擇進行核酸試驗或者2～4周以后隨訪WB檢測[1]。鑒于我國不同地區艾滋病流行強度,受檢人群感染率不同,通過VL檢測WB不確定樣本判斷為HIV感染的比例也各有不同,本研究中139例不確定樣本中病毒載量試驗VL>5 000 copies/mL占比25.9%,與朱曉娟等人研究結果相似[16],高于田文等人研究的結果3.96%[17],說明在不確定樣本中進行VL檢測確實可提高HIV感染確診率,及時發現HIV感染者,避免漏診造成HIV進一步傳播。本研究隨訪到位比例為15.8%,雖略高于其他研究10.26%[17],但仍處于較低水平,一方面是HIV受檢者人員流動性大,對其進行隨訪追蹤存在一定局限性,另一方面是VL確診后部分單位不再繼續送樣進行WB檢測。

WB陰性結果如果疑似“窗口期”感染或者有流行病學史、建議核酸或者隨訪。本研究首次在貴州省部分市(州)對所有WB抗體陰性結果開展核酸定量檢測試點工作,評價病毒載量試驗對WB陰性樣本診斷價值,為相關人員及時判定受檢者感染情況提供數據參考,最大程度避免漏診對個人和社會造成影響。同時對IMT試劑結果陰性、VL高值的樣本用麥克萊金HIV抗體診斷試劑盒進行WB復檢,排除了試劑影響因素。本研究中檢測到3.7%(6/159)WB帯型陰性、VL值是高病毒載量的樣本,在未經診斷后治療的情況下,這常見于感染后病毒非常活躍的窗口期,若無法及時對此類HIV感染者進行干預,這可能導致HIV感染者自身疾病進展迅速,無形中引起更危險的隱匿傳播,不利于艾滋病防治工作開展。比較WB和VL兩種檢測方法可發現,首先,WB隨訪結果雖然可作為HIV-1抗體不確定/陰性樣本金標準,但追蹤時間跨度大,隨訪率不高;其次,僅僅依靠WB檢測結果,WB帶型陰性實際VL是高病毒載量值感染者極容易被忽視,無法準確知曉自身感染情況,亦無法及時治療。值得注意的是,核酸定量檢測有時也會出現假陽性結果[18-19],當病載值低于檢測下限或者VL<5 000 copies/mL,此類檢測結果加以重視,再次進行復核。

綜上所述,為了更早、更準確的診斷HIV感染,及時發現HIV感染者,減少二代傳播,避免WB檢測技術窗口期造成漏診,在WB判定為不確定/陰性結果時應聯合HIV-1核酸定量檢測,對最終結果進行綜合判定,與WB檢測結果形成互補。