乳腺癌中LAMC2表達及臨床意義的生物信息學分析

趙碩,張慶雪,李靖若

(鄭州大學第一附屬醫院 乳腺外科,河南 鄭州 450000)

乳腺癌是常見的癌癥,約占女性癌癥的30%[1]。乳腺癌具有異質性,根據激素受體、人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)和Ki-67的狀態可以分為4種亞型,不同分型乳腺癌的治療方案不同,遵循個體化治療原則[2]。隨著乳腺癌綜合治療的完善,乳腺癌患者的生存率已經逐年提高。但是仍有部分患者對化療、免疫治療存在耐藥且部分年輕患者出現早期轉移[3]。因此,挖掘新型生物標志物對乳腺癌早期診斷、靶向治療及預后評估有著重要的臨床意義。

層粘連蛋白亞基γ2(laminin subunit γ2,LAMC2)基因編碼層粘連蛋白(laminin,LM)γ2鏈,位于人類染色體1q25-q31上,是LM-332蛋白的重要組成成分。LM-332參與組成基底膜,對細胞分化和運動、維持組織表型和促進組織存活起重要作用[4]。已有研究表明LAMC2在肺腺癌、食管鱗狀細胞癌和肝癌等腫瘤中表達異常[5-8]。Henning等[9]發現LAMC2在良性乳腺上皮基底膜中連續性表達,在浸潤性乳腺癌中表達缺失。本文將通過生物信息學分析進一步挖掘LAMC2在乳腺癌中的表達及臨床意義,為研究LAMC2基因在乳腺癌發生中的作用機制及潛在價值提供線索。

1 資料與方法

1.1 GEPIA2數據庫

GEPIA2數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/)是對來源于TCGA和GTEx數據庫中的腫瘤和正常樣本數據進行在線分析及可視化的工具。本研究利用GEPIA2工具中 “Expression DIY”的“Box Plot”功能,探索目標基因LAMC2在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達差異,設置條件:|Log2FC|cut off選擇“1”,P-value cut off為“0.01”,Log Scale為“Yes”,正常樣本選擇TCGA以及GTEx數據庫。利用GEPIA2工具中“Expression DIY”的“Correlation Analysis”功能,探索LAMC2和腫瘤干細胞標志物CD44、CD133之間的關系,設置條件:Correlation Coefficient為“Pearson”,TCGA Tumor為“BRCA Tumor”。

1.2 UALCAN數據庫

UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)用來補充驗證LAMC2在乳腺癌中不同淋巴結轉移狀態、不同分期、不同分子分型中的表達差異,并探究LAMC2表達與基因甲基化水平的關系。設置篩選條件:(1)Enter gene symbol為“LAMC2”;(2)TCGA dataset為“Breast invasive carcinoma”;(3)Links for analysis為“Expression/Methylation”;(4)based on為“Sample types/Individual cancer stages/Major subclasses/Nodal Metastasis status”。

1.3 HPA數據庫

HPA數據庫網址為https://www.proteinatlas.org。通過深度測序轉錄和免疫組織化學,提供了包含32個組織和47個細胞系的RNA和蛋白質水平的基因表達數據,提供了蛋白質在每個組織和器官的亞細胞中的定位。本研究在HPA數據庫中輸入目的蛋白LAMC2,在“Tissue”“Pathology”和“Subcell”3個模塊處分別獲取LAMC2蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌組織中的免疫組織化學圖片及亞細胞定位。

1.4 TIMER2.0數據庫

TIMER2.0數據庫(http://timer.cistrome.org)提供對腫瘤浸潤性免疫細胞的全面分析和可視化功能。本研究用TIMER2.0數據庫中的“Gene”和“Mutation”模塊,探索LAMC2基因的表達及突變狀態和乳腺癌腫瘤微環境中的6種免疫細胞(B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞)浸潤的關系。

1.5 KM Plotter數據庫

KM Plotter數據庫(https://kmplot.com/analysis/)是一種可以分析基因與癌癥患者預后關系的在線分析工具,其數據來源于GEO、EGA和TCGA數據庫。本研究首先選擇mRNA gene chip中的“Start KM Plotter for breast cancer”,設置條件:Affymetrix ID為“LAMC2(202267_at)”,Survival為“OS”,選擇“Auto select best cut off”為最佳截斷值,根據目標表達量將乳腺癌患者分為高低表達兩組,分別選擇不同的臨床病理參數(分子分型、組織學分級、淋巴結狀態),對其進行總生存期分析。其次選擇“mRNA RNA-seq”中的“Start KM Plotter for pan-cancer”,設置條件:Gene symbol為“LAMC2”,選擇“Breast cancer”,選擇不同的免疫細胞狀態對其進行總生存期分析。獲得生存曲線風險比(hazards ratio,HR)、95%可信區間(95% confidence interval,95% CI)和P值。

1.6 統計學方法

兩組數據間的比較,若數據服從正態分布,使用獨立樣本比t檢驗,若不服從正態分布,則使用U檢驗。TIMER2.0數據庫中,使用Spearman秩相關分析探索LAMC2基因表達量及突變狀態與免疫細胞浸潤水平的關系; KM Plotter工具中LAMC2基因的表達與乳腺癌患者預后關系的生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制,并使用 log-rank檢驗對兩組生存曲線進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMC2基因相對表達量

與正常組織相比,LAMC2在乳腺癌組織中表達下調,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1A、1B)。進一步分析乳腺癌中LAMC2的表達和臨床病理的關系,發現三陰性乳腺癌與Luminal型和HER-2過表達型乳腺癌相比LAMC2的表達上調,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1C)。LAMC2的表達水平和淋巴結狀態相關(圖1D),N3分別與N0及N1相比,LAMC2表達下調,差異有統計學意義(P<0.05)。在不同乳腺癌分期中,LAMC2的表達差異無統計學意義(P>0.05)(圖1E)。

A為GEPIA數據庫中LAMC2的差異表達;B為UALCAN數據庫中LAMC2的差異表達;C為LAMC2在不同分子分型中的表達;D為LAMC2在不同淋巴結轉移狀態下的表達;E為LAMC2在不同分期中的表達。

HPA數據庫中,LAMC2屬于人類疾病相關基因。免疫組織化學染色示LAMC2蛋白在乳腺癌組織中相對于正常乳腺組織中低表達,亞細胞定位示LAMC2在內質網和高爾基體中的表達并且被認為是分泌蛋白(圖2)。

A為正常乳腺組織;B為乳腺癌組織;C為亞細胞定位。

2.2 LAMC2基因與甲基化之間的關系

LAMC2是1個超甲基化基因,且在乳腺癌和正常乳腺中甲基化水平不同,差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 乳腺癌和正常乳腺組織中LAMC2基因甲基化水平

2.3 LAMC2與乳腺癌干細胞及免疫細胞浸潤之間的關系

利用GEPIA2數據庫在線分析,LAMC2基因的表達和乳腺癌干細胞標志物CD44、CD133的表達水平均呈正相關(圖4)。

圖4 乳腺癌中LAMC2的表達和CD44、CD133的關系

通過TIMER2.0數據庫探索LAMC2基因表達與乳腺癌腫瘤微環境中6種免疫細胞浸潤水平的關系,見圖5。LAMC2基因的表達水平與B細胞浸潤水平呈正相關,與CD8+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞的浸潤水平呈負相關。進一步探索免疫細胞浸潤和LAMC2基因突變狀態之間的關系,僅B細胞浸潤水平和LAMC2基因突變有關,在LAMC2突變組B細胞浸潤水平相對升高,差異有統計學意義(P<0.05),其他5種免疫細胞浸潤水平和LAMC2突變狀態相關性不強,差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 LAMC2基因表達與乳腺癌患者總生存期的關系

與LAMC2低表達患者相比,LAMC2高表達患者有更長的總生存期,差異有統計學意義(P<0.05),見圖6。

A為基于mRNA的基因芯片數據進行生存分析;B為基于mRNA的RNA測序數據進行生存分析。

2.4.1不同臨床病理下乳腺癌患者LAMC2基因表達與總生存期的關系

在Luminal A型乳腺癌、乳腺癌組織學Ⅰ級、Ⅱ級和淋巴結未轉移患者中,LAMC2的表達和患者總生存期呈正相關,差異有統計學意義,見表1。

表1 不同臨床病理特征下LAMC2基因表達與乳腺癌患者總生存期的關系

2.4.2不同免疫細胞浸潤下乳腺癌LAMC2基因表達與總生存期的關系

在腫瘤微環境B細胞浸潤減少型、CD8+T細胞減少型、富含巨噬細胞型或巨噬細胞減少型中,LAMC2高表達者預后較好,見表2。

表2 不同免疫細胞浸潤水平下LAMC2表達和乳腺癌患者總生存期的關系

3 討論

癌細胞突破基底膜向間質浸潤是轉移的第一步,LM是基底膜的主要組成成分。基底膜中的LM γ2亞基參與半橋粒復合體的組成,半橋粒復合體是上皮細胞穩定黏附到基底膜上的結構支持[10]。正常乳腺組織含有半橋粒復合體,浸潤性乳腺癌缺少半橋粒復合體,在腫瘤中,它們的缺失可能與正常細胞結構的喪失有關,從而使癌細胞易穿透基底膜發生遷移[11]。LAMC2在多種腫瘤中出現表達異常[8]。通過生物信息學分析LAMC2在乳腺癌中的表達和臨床意義,挖掘其作為乳腺癌潛在生物標志物的價值。

本研究通過數據庫分析發現LAMC2基因在乳腺癌組織中表達下調,且LAMC2基因的表達與乳腺癌分子分型及淋巴結轉移狀態密切相關,三陰性乳腺癌中LAMC2的表達和Luminal型和HER-2過表達型乳腺癌相比上調,這和Carpenter等[12]的研究結果一致,LMγ2亞基參與組成的LM-332在三陰性乳腺癌中表達,在雌激素受體陽性的乳腺癌中不表達。LAMC2低表達乳腺癌患者的總生存期更短,且LAMC2和患者預后的關系受臨床病理的影響。這些結果提示LAMC2基因的異常表達與乳腺癌的發生發展有關。分析原因,LAMC2基因低表達影響LM-332亞型的合成,進行破壞了基底膜的正常結構和正常導管結構喪失[13],半橋粒復合體合成障礙,使癌細胞在向周圍組織浸潤過程中失去了基底膜保護屏障。LMγ2亞基可以在基質金屬蛋白酶的作用下水解產生至少兩個表皮生長因子樣序列的DⅢ片段,水解釋放的DⅢ片段通過結合表皮生長因子受體并介導的細胞內信號,促進乳腺癌細胞的遷移[14]。乳腺癌組織中可能存在LMγ2亞基和DⅢ片段比例的失調,即低LM γ2亞基/高DⅢ片段狀態。LAMC2在乳腺癌中低表達可能和乳腺癌中基質金屬蛋白酶上調有關[15]。

通過數據庫分析發現在乳腺癌中LAMC2是一個超甲基化基因,甲基化可能是LAMC2基因低表達的機制之一。但數據庫中乳腺癌LAMC2基因甲基化水平相對正常乳腺組織低,可能是因為基因之間存在互作關系,上游基因甲基化水平高、存在MicroRNA的調節或者其他通路的影響,導致乳腺癌中LAMC2表達下調,具體機制需要進一步研究。此外,腦轉移和肺轉移是晚期乳腺癌患者生活質量下降和預后不良的主要原因[3]。在小鼠乳腺癌腦轉移動物模型中,異型腫瘤-星形膠質細胞相互作用發生局部黏著斑激酶磷酸化,誘導腦轉移微環境中的LAMC2表達和LM-332的沉積,從而調控乳腺癌細胞在大腦中的定植[16]。在乳腺癌肺轉移微環境中由LMγ2亞基參與構成的LM-332蛋白在高濃度下可以促進乳腺癌細胞的遷移[17]。總之,LAMC2基因正常表達是維持正常乳腺上皮細胞的表型的前提,在乳腺癌組織中的低表達和乳腺癌的發生有關,在腦或肺轉移微環境中的高表達和乳腺癌細胞的轉移定植有關。

利用GEPIA2數據庫分析發現乳腺癌中LAMC2的表達和腫瘤干細胞標志物CD44、CD133呈正相關。CD44是重要的乳腺癌干細胞標志物,乳腺腫瘤中高占比的乳腺癌干細胞已被證明與不良后果相關[18]。Sato等[19]研究發現LMγ2的氨基酸末端片段通過與CD44的相互作用刺激侵襲性乳腺癌細胞的遷移。Brugnoli等[20]發現CD133可以作為非侵襲性和侵襲性乳腺腫瘤細胞惡性程度增加的指標,直接調節與轉移和耐藥相關的蛋白的表達。本研究通過數據庫分析發現LAMC2在三陰性乳腺癌中的表達相對Luminal型和HER-2過表達型上調,可能和三陰性乳腺癌中富含腫瘤干細胞有關[21];此外,LAMC2還可以通過LncRNA T376626促進三陰性乳腺癌細胞增殖和轉移[22]。乳腺癌干細胞的主要免疫抑制特征之一是程序性死亡受體-配體1的表達,與效應T細胞的細胞表面程序性死亡受體1結合,導致其衰竭[23]。

通過數據庫分析發現乳腺癌中LAMC2的表達水平和與患者總生存期的關系受腫瘤微環境中免疫細胞浸潤水平的影響。研究發現在非小細胞肺癌和食管鱗狀細胞癌中LMγ2亞基被癌癥相關成纖維細胞分泌的轉化生長因子-1通過JNK/AP1信號轉錄激活,該信號通過改變T細胞受體的表達阻止了T細胞向腫瘤巢穴的浸潤,減弱對抗程序性死亡受體1療法的反應[24]。免疫抑制劑可用于治療程序性死亡受體-配體1陽性的晚期三陰性乳腺癌[25]。三陰性乳腺癌中LAMC2的表達相對其他乳腺癌分型上調,可能通過介導免疫細胞參與免疫逃逸,部分患者產生耐藥。在胰腺癌中LAMC2的表達可以預測患者對吉西他濱耐藥的治療反應[26]。在三陰性乳腺癌中LAMC2的表達是否可以預測抗程序性死亡受體1療法的反應有待進一步研究。本研究有一定的局限性,利用生物信息學分析獲得的結果還需要進一步臨床和實驗驗證。

4 結論

LAMC2基因在乳腺癌中表達下調且其表達與乳腺癌總生存期的關系受不同臨床病理因素的影響,LAMC2基因的表達和腫瘤微環境中的腫瘤干細胞和免疫細胞浸潤水平有關。這些結果可以為LAMC2基因與乳腺癌關系的研究提供線索,監測LAMC2表達可以為乳腺癌的治療及預后評估提供重要的參考價值。