YAP-shRNA載體構建及其對食管鱗癌細胞系生物學行為的影響

韓高揚,李小麗,王瑞娟,韓玉杰,張仁鋒,魏創業,孔曉煌,連歡歡,王金龍

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫院 胸外科,河南 鄭州 450007;2.鄭州大學第一附屬醫院 腫瘤科,河南 鄭州 450000)

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是造成死亡的第六大癌癥[1],全球總發病率的85%左右發生在發展中國家,中國占全球EC病例的50%以上,每年約27萬例[2]。盡管手術切除、輔助放化療和免疫治療等措施有所進展,但食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的5 a生存率仍然很低[3]。傳統的治療方法還遠遠不能令人滿意。與大多數其他癌癥一樣,ESCC的發展是復雜的,其發生機制尚未完全闡明。

Hippo信號傳導通路最初是以果蠅Ste20樣激酶Hippo而命名的通路。Hippo通路主要的生物學效應包括控制細胞的分化、調節細胞增殖凋亡平衡、維持細胞的接觸性抑制及參與腫瘤的發生[4]。Hippo信號通路故障,動態平衡被破壞,會導致細胞增殖異常,甚至腫瘤的發生[5]。在Hippo信號傳導通路中尋找新靶點,在分子水平、細胞水平、動物實驗和臨床試驗等方面研究治療惡性腫瘤的方法,已成為現在研究Hippo信號傳導通路的主要方向。其中Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo信號傳導通路下游的關鍵效應分子,在人體內,Hippo通路參與細胞增殖的負調控,YAP磷酸化后是抑制轉錄的關鍵因子,但有些研究表明YAP是一個癌基因,可促使正常細胞向惡性腫瘤細胞分化。因此本實驗通過研究YAP在ESCC中的表達情況,并構建YAP-shRNA來了解其對食管鱗癌細胞系生物學行為的影響,以期找到食管癌治療的新靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2016年6月在鄭州大學第一附屬醫院胸外科接受食管癌根治術且病史資料完整的122例食管鱗癌組織標本,同時取正常食管組織(距惡性腫瘤>5 cm)。患者術前無放療、化療和免疫治療史,所有患者均自確診之日起進行隨訪,直至2021年6月1日或患者死亡,其中10例患者隨訪失聯,此項研究得到了鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會的支持。按2017年國際抗癌聯盟最新的食管癌TNM分期(第8版)進行分期[6]。由3名不知此研究內容的病理科醫生共同判定病理切片免疫組化評分。

1.2 免疫組化結果判定

采用半定量法,結合染色強度和染色范圍評判YAP表達結果。根據病理切片染色的強度和染色陽性細胞占總細胞的比率進行評分。染色強度:陰性(強度和陰性對照類似)為0分;弱陽性(淡黃色)為1分;陽性(黃色)為2分;強陽性(棕黃色)為3分。染色陽性細胞占比:陽性細胞數<10%為0分,10%～30%為1分,3l%～51%為2分,52%～70%為3分,>70%為4分。結合染色強度與染色陽性細胞占比的乘積進行綜合判定:0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為陽性(++),9～12分為強陽性(+++)。

1.3 細胞培養

人食管鱗狀細胞系EC9706和EC109(購自中國科學院上海細胞庫)在含有10%(體積分數)胎牛血清的RPMI-1640(Gibco,Invitrogen,NY,USA)中培養。培養溫度為37 ℃,二氧化碳體積分數為5%。細胞在轉染前24 h接種在六孔板中。

1.4 質粒與轉染

針對不同的靶序列(表1),設計了5種用于YAP敲除的shRNA質粒:pGPU6-YAP-1103(shRNA1)、pGPU6-YAP-2217(shRNA2)、pGPU6-YAP-1862(shRNA3)、pGPU6-YAP-1662(shRNA4)和pGPU6-YAP-shNC(shNC)的陰性對照質粒。使用Attractene轉染試劑(德國希爾登Qiagen)將質粒轉染到相應細胞中。48 h后采用qRT-PCR檢測各組YAP RNA表達情況,72 h后采用蛋白質印跡檢測各組YAP蛋白表達情況,以評估5種質粒的有效性,從而為后續實驗選擇最佳質粒。

表1 5種不同的靶序列

1.5 qRT-PCR檢測

48 h后利用TRIzol(Invitrogen Corporation,加利福尼亞州卡斯巴德)試劑從細胞中提取RNA。按逆轉錄試劑盒說明書(美國賽默飛世爾科學公司)對每個RNA樣本(1 μg)進行逆轉錄合成cDNA合成。然后利用qRT-PCR檢測YAP基因表達量。以管家基因β-actin作為內參,YAP引物序列和β-actin引物序列如(表2)所示。每組設3個復孔,以β-actin作為參照,計算Ct均值,應用相對定量法2-ΔΔCt進行定量分析。

表2 YAP引物序列和β-actin引物序列

1.6 蛋白質印跡檢測各組YAP蛋白表達情況

72 h后提取蛋白,采用紫外分光光度計測提取蛋白的水平,配制分離膠,水封,加濃縮膠,跑膠,電泳轉膜,封閉,加入一抗(1∶200),在4 ℃冰箱內過夜孵育,用TBST液洗膜3遍,然后再加入稀釋的二抗(1∶2 000)進行孵育,用TBST液洗滌3遍,最后加熒光顯影劑顯影。

1.7 Transwell小室檢測侵襲能力

用YAP-shRNA2和YAP-shNC轉染EC9706和EC109細胞系,并進行培養。48 h后先用胰蛋白酶分離細胞,再用PBS洗滌,培養在無血清培養液中。在下室中加入600 μL的含血清的培養液,稀釋腫瘤細胞懸液至每毫升1×105個,并吸取200 μL細胞懸液加入上室中。在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養72 h。用棉簽擦去濾膜上方未穿出的腫瘤細胞,濾膜用40 g·L-1多聚甲醛固定,時間約30 min,用結晶紫染色,切下的膜固封在載玻片上,在倒置顯微鏡下計膜背面的細胞數,計四周和中間的3～4個視野,然后計算出平均值。

1.8 CCK8檢測增殖能力

用YAP-shRNA2和YAP-shNC轉染EC9706和EC109細胞系,把細胞的水平調整為每毫升1×104個,調整好的細胞懸液按照每孔100 μL的上樣量加到 96孔板內,每組細胞5個復孔。在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養,分別在12、24、36、48 h在每孔細胞的懸液中加入10 μL的CCK8溶液,然后繼續在培養箱中孵育。1 h后從培養箱中取出96孔板,用酶標儀在450 nm處測定各組的吸光度,記錄每組5孔的數值,并取平均值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析,運用χ2檢驗進行統計分析,并以Cox回歸模型行多因素預后分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化結果

YAP蛋白在食管正常組織中染色呈淡黃色,染色部位主要集中于細胞核,少數為細胞質,染色陽性率為9.7%,YAP蛋白在食管鱗癌組織中染色呈棕黃色,在大部分細胞核和細胞質中均染色,陽性率為64.8%(圖1)。通過分析,發現YAP蛋白在食管鱗癌組織中的表達與正常食管組織中表達差異具有統計學意義(P<0.05),不同年齡、性別、分化程度、腫瘤大小患者的YAP蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05),但淋巴結轉移有統計學意義(P<0.05)(表3)。通過隨訪發現食管鱗癌YAP陽性的患者生存期縮短(圖2)。

A和B為YAP在正常食管組織的細胞核和細胞質中呈陰性表達;C和D為YAP在食管鱗癌細胞核和細胞質中呈陰性表達;E和F為YAP在食管鱗癌細胞核和細胞質中陽性表達;A、C、E放大倍數為200×,B、D、F放大倍數為400×。

圖2 食管鱗癌患者的生存曲線

表3 YAP表達與食管鱗癌臨床病理因素分析(n=122)

2.2 質粒對YAP基因表達的影響

本研究設計了5種不同YAPshRNA(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shNC),經過轉染EC9706和EC109細胞系,運用qRT-PCR和蛋白質印跡來檢測YAP在該細胞中的表達情況(圖3),檢測可見經shRNA2和shRNA3轉染的EC9706和EC109細胞,YAP表達較低,且shRNA2優于shRNA3,從而挑選出shRNA2為最有效質粒,并培養經shRNA2轉染的EC9706和EC109細胞系做下一步實驗。

A為RT-PCR檢測YAP在EC9706和EC109中的表達;B為蛋白質印跡檢測YAP在EC9706和EC109中的表達(shRNA1,shRNA2,shRNA3,shRNA4,shNC)。

2.3 YAP的沉默對腫瘤細胞侵襲和增殖能力的影響

采用Transwell小室實驗來檢驗轉染前后腫瘤細胞的侵襲能力,通過計算YAP-shRNA2和YAP-shNC組在Transwell小室中72 h后的穿膜細胞數,可以看到YAP-shRNA2組穿膜的細胞數明顯減少(圖4),差異具有統計學意義(P<0.05)(圖5),提示YAP基因的沉默能夠抑制EC9706和EC109的侵襲能力。

圖4 Transwell小室的穿膜細胞

圖5 Transwell小室的穿膜細胞數

采用CCK8實驗來檢驗轉染前后腫瘤細胞的增殖能力,用酶標儀在490 nm處測定各組的吸光度,記錄每組5孔的數值,并取均值。通過繪制生長曲線顯示YAP-shRNA2組的增殖數明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05)(圖6),提示了YAP基因的沉默能夠抑制EC9706和EC109的增殖能力。

圖6 細胞系的生長曲線

3 討論

YAP在多種惡性腫瘤中高表達已被證實[7-8],然而關于YAP的表達與食管鱗癌的臨床病理因素之間的關系及對食管癌細胞系生物學行為的影響卻少有報道。在此次研究中,通過對食管鱗癌臨床病理因素的分析,證實YAP在食管鱗癌組織中高表達與淋巴結轉移密切相關,且YAP高表達的食管鱗癌患者的生存時間縮短,通過shRNA轉染EC9706和EC109細胞系使其YAP表達降低,轉染后的EC9706和EC109細胞系通過Transwell小室實驗和CCK8實驗證實其侵襲和增殖能力降低。

Hippo信號傳導通路的異常可導致惡性腫瘤發生,因而被廣泛關注。YAP是位于染色體11q22上的候選癌基因[9-11],在卵巢癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達,且其表達位于細胞核和細胞質[12-17]。一項納入115例肝癌組織標本的研究顯示,YAP的表達與AFP水平呈正相關,并且是影響肝癌患者生存期的獨立預后因素[18]。對122例食管鱗癌組織進行了免疫組化研究,研究發現其中64.8%的食管鱗癌組織的細胞核和細胞質中表達YAP,且與正常食管組織表達差異有統計學意義,雖然不同年齡、性別、分化程度、腫瘤大小患者的YAP表達差異無統計學意義,但YAP的表達差異與淋巴結轉移相關。結果表明,YAP是在食管鱗癌中高表達的癌蛋白,且與食管鱗癌的不良預后相關。

Hippo信號傳導通路可調節細胞增殖和凋亡,使內環境處于動態平衡的狀態,而YAP是Hippo信號傳導通路下游的關鍵效應分子。作為候選癌基因,YAP已被證實是調節器官大小和細胞增殖的因子[19]。轉基因小鼠肝臟中YAP的過度表達可將肝臟質量從體重的5%增至約25%,并最終導致腫瘤的發生[20]。肝癌中YAP表達的降低可使腫瘤細胞的遷移能力降低,G0/G1期細胞數量顯著增加[21]。為了了解YAP對ESCC生物學行為的影響,本研究沉默了EC細胞系中的YAP。YAP-shRNA2轉染EC9706和EC109細胞系后,YAPmRNA和YAP蛋白表達水平低于對照組,并且侵襲和增殖能力降低,與以上結果基本一致。

4 小結

YAP作為一種癌蛋白在食管鱗癌中高表達,并且可以增加癌細胞的侵襲和增殖能力。此外YAP的高表達可導致食管鱗癌患者的生存率降低,因此YAP可成為未來食管癌治療的新靶點。但YAP在食管鱗癌中的分子機制及功能還需要進一步努力闡明。