雞性別決定及分化關鍵調控基因DMRT1研究進展

鄭 鋼,連 玲

(中國農業大學 動物遺傳資源與分子育種實驗室,北京 100193)

根據FAO(https:∥www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL)統計數據,1961—2021年間,全球雞蛋產量從1 438萬噸猛增至近8 639萬噸,中國是世界上最大的雞蛋生產國,占全球生產總量的1/3左右。在規?；半u養殖產業中,雛雞出生1日齡便對其進行性別鑒定,母雛全留,公雛被淘汰。據不完全統計,每年全球有將近60～70億只公雛被撲殺[1],這不僅造成了巨大的經濟損失,同時還面臨嚴重的倫理問題。雛雞的性別鑒定方法主要有翻肛法、羽色法和羽速法[2],這些方法都是通過對1日齡雛雞進行人工性別鑒定,為了節省孵化成本,越來越多的學者致力于探索性別早期鑒定的方法,比如以DNA檢測為主的分子生物學方法、依據種蛋蛋形指數的蛋殼形態檢測方法、以拉曼光譜和高光譜為主的光譜檢測方法、提取尿囊液進行激素檢測等,見表1[3]。但這些方法均存在一定的缺陷,如需要打開蛋殼等操作,存在影響胚胎發育的風險,同時上述方法也有檢測準確率低、判定時間較晚等問題,此外分子生物學檢測和光譜檢測在應用上還存在操作復雜或檢測成本高等問題,基于揮發物組成差異進行檢測目前僅針對于京粉一號品種,且對試驗環境和設備精度要求很高。隨著生物技術的飛速發展,通過生物學手段人為控制或者逆轉性別已成為可能。從性腺發育、分化以及性別決定基因入手挖掘性別控制的遺傳基礎已成為研究熱點,其在科學研究以及產業應用上均具有重要價值。

表1 雞種蛋胚胎性別檢測方法比較[3]

哺乳動物性染色體組成為X/Y,雌性表現為同配(XX),雄性表現為異配(XY)。在奶牛上,通過流式細胞術分離攜帶X或Y的精子,能有效實現對后代性別的控制,但還存在受孕率低及高成本問題[4];而雞和其他鳥類動物與此相反,雄性表現為同配(ZZ)而雌性表現為異配(ZW),由于染色體組成的差異,無法在雞上采取同樣的精子分離方法進行有效的性別控制。早在1991年,研究人員就鑒定了哺乳動物中的Y染色體連鎖的睪丸決定基因SRY(sex determining region Y)[5],但目前為止,在包括雞等鳥類動物中未能找到與SRY等效的性別決定基因,這提示鳥類動物存在不同的性別決定方式。

鳥類動物的性別決定過程受到性染色體(ZZ/ZW)調控,這些性染色體中的一條或兩條攜帶的基因在雞胚發育早期能控制性別分化,在雄性個體中左右性腺都發育形成睪丸,而在雌性個體中,性腺發育左右不對稱:左側性腺產生功能性卵巢,而右側性腺退化。雞等鳥類動物的性別決定機制目前主要有兩種假說[6]:一是Z染色體劑量效應假說:只有一條Z染色體的個體發育為雌性,有兩條Z染色體的個體發育為雄性,該假說認為Z染色體劑量依賴機制是雞性別決定的基礎。其中Z連鎖DMRT1(doublesex and mab-3 related transcription factor 1)基因的劑量效應是Z染色體劑量效應假說中最典型的證據,DMRT1在胚胎性腺發育中起關鍵作用,是調節睪丸發育形成的關鍵基因。二是W染色體顯性效應假說:即W染色體上存在有顯性的雌性發育相關基因能直接調控雌性性別決定過程,相關研究工作[7-9]發現一些W染色體連鎖基因可能直接參與控制雌性的性別決定過程和表型的發生過程。Shaw等[10]和Lin等[11]發現,具有3A:ZZW(A:常染色體Autosome)基因型的三倍體雞表現為兩性中間體,這些雞有一個右側睪丸和短暫出現的左側卵巢(卵巢隨年齡增長而逐漸退化),在發育成熟后表現為雄性外型。這表明,W染色體帶有雌性性別決定相關基因,因為盡管存在兩條Z染色體,仍可能形成一些卵巢組織,該發現也側面佐證了Z染色體劑量對性別決定的重要影響。除上述兩個假說外,激素調控以及細胞自主性識別(cell autonomous sex identity,CASI)假說也被廣泛提及,激素調控性別假說認為由性腺分化而產生的性激素在性別分化中起調控作用,通過阻斷或外源添加雌激素,能分別使雌雞或雄雞出現異性的性別特征,激素調控理論更多的是強調在性腺分化的基礎上,性腺分泌的激素參與到性別分化進程。細胞自主性識別假說認為雞等鳥類體細胞具有固有的性別識別方式,其性別分化本質上是細胞自主的[12],該假說認為雄性和雌性的差異主要不是由于激素作用的結果[13],且激素水平的改變不影響雞等鳥類動物的體細胞自主性識別過程,這一點區別于人等哺乳動物激素水平對個體發育形態的影響,說明在雞等鳥類動物中不以激素調節性別表型,提示這種特殊的調控機制背后涉及到復雜的基因調控。

本文綜述雞性別決定及分化關鍵調控基因DMRT1的研究進展,從多個角度剖析DMRT1在雞胚性別決定及分化中的重要作用以及影響DMRT1表達的潛在因素,為深入研究DMRT1在雞等鳥類動物性腺分化中的作用以及為研究雞性別調控相關理論提供參考。

1 雞胚性別決定及分化進程

性別決定是指有性繁殖生物中,產生性別分化,并形成種群內雌雄個體差異的基礎,性別分化指受精卵在性別決定的基礎上,進行雌性或雄性性狀的發育過程。脊椎動物的性別決定分為遺傳型性別決定(genetic sex determination,GSD)和環境型性別決定(environment dependent sex determination,ESD)[14]。哺乳動物和鳥類的雌雄兩性個體具有明確的性染色體差異,其性別決定過程受性染色體的遺傳調控[15]。性腺是由生殖細胞和體細胞兩類細胞組成的,原始生殖細胞 (PGC)來源于胚胎發育早期的中胚層,然后經過定向遷移到達生殖嵴(genital ridge),與性腺體細胞共同發育為性腺。值得注意的是,與其他脊椎動物不同,雞胚胎支持細胞(sertoli cells)并非來自腔上皮,它們來自DMRT1(+)/PAX2(+)/WNT4 (+)/OSR1(+)間充質細胞群,在生殖細胞遷移到性腺的早期,這些細胞定植于未分化的生殖嵴[16]。另外,雌雄雞胚早期都有兩套原始生殖管道:一對沃爾夫氏管(Wolffian duct,又稱中腎管)和一對繆勒管(Mullerian duct,又稱中腎旁管)。在雄性個體中,沃爾夫氏管發育形成雄性生殖管道,而繆勒管退化;而在雌性個體中,沃爾夫氏管退化,繆勒管則形成雌性生殖管道。

雞最早期性別決定發生在雞胚受精卵形成時,由差異化的染色體組成(ZZ/ZW)決定。雞胚性腺發育歷程簡化如圖1所示[17]。雞的胚原基(原始性腺)在胚胎發育E3.5 d開始形成并發育成原始生殖嵴,有報道指出早在E2.0 d時[18],側板中胚層(LPM)腹內側的細胞就被確定為性腺祖細胞(GPC),GPC在E2.0 d-E3.0 d 時受Hedgehog信號激活進而分化形成性腺細胞并形成生殖嵴,E3.0 d時腹內側出現明顯的增厚,這是雞性腺發生的第一個跡象;在E3.5 d-E4.5 d時,還無法在形態上區分性腺的雌雄差異,在E5.5 d時,性腺在形態上表現是外部上皮細胞層和密集的下層髓質中的細胞索,到E5.5 d-E6.5 d開始出現形態上的差異,逐漸分化形成雌/雄性腺。在雄性胚胎中,性腺皮質開始退化,生殖細胞與髓質相互作用形成生精小管索結構。而在雌性胚胎中,左側性腺體細胞和生殖細胞在皮質內增殖,皮質層顯著增厚,右側性腺則開始退化;在E6.5 d-E21.0 d期間,兩性性腺出現顯著形態學差異:雄性睪丸對稱且大小相似,兩側性腺組織中的皮質層進一步變薄,髓質形成管腔結構,生殖細胞與周圍的支持細胞組成生精小管索。而雌性卵巢組織不對稱,左側性腺皮質層逐漸增厚且結構致密,髓質結構疏松,卵母細胞開始進行減數分裂,盡管右性腺也能類似于左性腺發生髓質空泡化,但它無法形成增厚的富含生殖細胞的皮質,右側性腺逐漸發生萎縮。相關生殖管道的發育在雞兩性間也存在差別,雄性繆勒管在孵化E8.0 d停止發育,并在E12.0 d消退;而雌性左側繆勒管發育形成輸卵管,右側導管在E12.0 d后經歷相對緩慢的退化后在孵化時完全消失[19]。

2 雞胚性別決定或者性別分化過程中涉及的重要基因

雞胚早期性別決定和性別分化過程中涉及很多相關基因的參與。目前研究較多的基因主要有DMRT1、SF1(orphan nuclear receptor steroidogenic factor-1)、LHX9(LIM homeobox protein)、DAX1(NR0B1,nuclear receptor subfamily 0 group B member 1)、SPIN1/SPIN1 L(spindling 1/spindling 1 like)、SOX9(sry-box transcription factor 9)、HEMGN(Z-linked male factor,hemogen)、AMH(anti-Mullerian hormone)、WT1(Wilms tumor 1)、CYP19A1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1)、FOXL2(forkhead box L2)、ESR1(estrogen receptor 1)、HINTW(histidine triad nucleotide binding protein W)、UBE2I(ubiquitin conjugating enzyme E2 I)、WNT4(Wnt family member 4)等。其中DMRT1、AMH、SOX9、HEMGN等在雄性發育中起關鍵調節作用,而CYP19A1和FOXL2等在雌性發育中起關鍵的調節作用。上述基因中,DMRT1被廣泛認為是調控公雞睪丸形成的核心基因,DMRT1基因的劑量直接影響雞性別決定進程。

3 DMRT1簡介及胚胎期原位表達

DMRT1最早在無脊椎動物中被發現,是一種古老的性別決定基因,是少數幾個在魚類、龜類、鱷魚、兩棲動物、鳥類和哺乳動物的代表性物種中被繪制的性別相關基因之一[20],DMRT1在許多進化物種中均表現出性別二態性(指同一物種不同性別之間的差別)表達,是脊椎動物性別決定通路中的保守成分[21-22]。雞DMRT1基因位于Z染色體26.45～26.50 Mb之間,其編碼的mRNA長度為1 244 bp,由6個外顯子組成,經典蛋白產物長度是365 aa(Uniprot)。DMRT1蛋白位于核內,是DM結構域(DM domain)家族轉錄因子之一,DM結構域在進化中高度保守,DM結構域基因是最早在脊椎動物和無脊椎動物門類中顯示出性別二態性表達的基因[21]。

DMRT1的表達具有很強的組織特異性,主要在性腺及相關組織中表達。Omotehara等[23]于2014年研究了雞胚胎發育過程中DMRT1蛋白在雄性和雌性雞胚的泌尿生殖系統(包括繆勒管)的表達模式(圖2)。發現在性別決定的推測期(E4.5 d)之前,雄性未分化性腺的性腺體細胞與雌性相比表現出更強的DMRT1的表達,在雞胚性別決定之后的E6.5 d,雄性雞胚形成睪丸索的支持細胞表達DMRT1,同時發現在性別開始分化的E4.5 d后,雄性和雌性的生殖細胞同樣能表達DMRT1,但在雄性雞胚的表達是連續的,而在雌性雞胚發育過程中,在左側卵巢皮質生殖細胞中的表達不連續-從左側卵巢皮層中央部分的生殖細胞向兩側邊緣逐漸消失。同時DMRT1也在E4.5 d-E7.5 d的輸卵管嵴(繆勒管的前體)中被檢測到,在雌/雄雞胚繆勒管的間充質和最外層的腔上皮都能檢測到DMRT1的表達,DMRT1在雄性繆勒管退化前表達高,在E8.0 d,雄性繆勒管消退,DMRT1表達僅限于間充質區域,而雌性表達模式沒有變化。盡管該研究對DMRT1基因原位表達做了較為詳細的論述,但該研究僅主要集中在E4.5 d-E15 d,相關研究發現早在E3.5 d的雞胚生殖嵴中就已經有DMRT1的表達[24],有關覆蓋胚胎性腺發育全階段DMRT1的時空表達圖譜還有待進一步的完善。

線寬表示與異性相比的相對表達水平。陰影線表示性別決定的推定期

值得一提的是Ayers等[25]在2015年報道了DMRT1不僅在早期形成的雞胚繆勒氏管嵴中表達,還在導管形態發生期間經歷從上皮細胞轉變到在間充質細胞中表達,同時發現在雞胚中敲低DMRT1會導致間充質層大大減少,阻斷導管管腔上皮的尾部延伸,因此提出DMRT1是繆勒管發育的早期必需步驟。然而Ioannidis等[26]在2019年研究DMRT1基因敲除后的雞胚(Z-W)發育時,發現其能形成正常左側繆勒管,該結果對DMRT1在繆勒管發育早期的必要性提出了質疑。值得注意的是Omotehara等[27]在2017年研究發現,部分表達DMRT1的皮質細胞僅在左側睪丸發育開始后對左側睪丸髓質中的支持細胞有貢獻,結果表明DMRT1在睪丸中的表達存在不對稱性。

4 雄性雞睪丸形成依賴于DMRT1基因劑量

早在1999年,Raymond[28]就發現DMRT1在雞性別分化之前的生殖嵴和沃爾夫氏管中表達,且在ZZ型胚胎中的表達水平高于ZW胚胎;Shan等[24]在2000年的研究中發現,DMRT1在E3.5 d的雄性生殖嵴中的表達高于雌性;Nanda等[29]在2000年基于染色體同源性研究中發現,DMRT1基因與人類上的直系同源物和人類XY性別逆轉相關,提出DMRT1是脊椎動物性別決定最早期的劑量敏感基因。Oréal等[30]在2002年通過對性腺分化前后相關基因表達趨勢的分析,發現在E5.0 d時DMRT1在整個性腺中表達,但由于原位雜交技術的局限性,未在此階段揭示該基因表達是否存在明確的性別二態性,但在E6.0 d的雞胚中,雄性比雌性顯著高表達。隨后,E7.0 d的雄性性腺中出現AMH和DMRT1的高表達(DMRT1在雄性性腺中比雌性性腺表達高兩倍以上)以及SOX9的開始表達,且同時伴隨著睪丸索的形成;除上述基因外,其他基因不呈現顯著的性別二態性。另外,Yamamoto等[31]在2003年發現DMRT1表現出雄性特異性表達模式,提出DMRT1、SOX9和AMH在E5.5 d-E8.5 d時與睪丸形成有關。

Smith等[32]2003年在使用芳香酶抑制劑FAD(fadrozole)誘導的雌性反轉為雄性的雞胚中分析DMRT1的表達,發現性反轉胚胎DMRT1表達水平升高,該現象與具有兩個Z染色體拷貝的正常雄性個體相似,基于此結果,他認為睪丸發育中確實涉及DMRT1基因上調,但兩個拷貝DMRT1并非是必須的;此外鄭江霞和楊寧[33]在2007年,利用經芳香化酶抑制劑處理產生的性反轉雞胚進行試驗,也發現DMRT1的上調表達與睪丸形成有關。2009年,Smith等[34]給出了有關DMRT1表達與雞性別決定有關的最直接證據,他們使用RNA干擾技術(RNAi)敲低早期雞胚中的DMRT1基因,發現試驗組的雄性表現出部分性別逆轉,導致遺傳雄性(ZZ)胚胎出現性腺的雌性化,包括左性腺顯示雌性樣組織、睪丸索紊亂、睪丸標志物SOX9下降。該研究還發現,在性腺雌性化的ZZ雞胚中,卵巢標志物芳香酶被異位激活,而且相比較于左側性腺,右側性腺DMRT1和異位芳香酶活化的變化更大,表明左右性腺對DMRT1的敏感性不同。

隨后Lambeth 等[35]在2013年使用逆轉錄病毒載體RCASBP在雞胚中異位表達芳香酶基因CYP19A1,發現雄性雞胚胎中過表達CYP19A1誘導了雄性性腺向雌性的反轉,此外還發現雄性性腺發育的關鍵基因DMRT1、SOX9和AMH的表達受到抑制,性反轉雄性個體的生殖細胞分布和雌性相似。同年,Fang等[36]的研究指出在性別決定和性腺分化期間,由外源雌激素誘導雄性到雌性的性反轉胚胎中,在E3.0 d-E5.0 d期間DMRT1表達活性較低。隨后2014年Lambeth[37]的研究還發現,DMRT1在雄性胚胎性腺中表達上調是出現在HEMGN、SOX9和AMH表達之前的,這表明DMRT1在胚胎雄性性別決定中處于更靠前的位置,另外過表達DMRT1會誘導雄性發育相關基因的表達并拮抗胚胎性腺中的雌性相關途徑,而在雌性性腺中異位表達DMRT1能誘導局部AMH、SOX9、HEMGN等雄性相關基因的表達。

2017年Hirst 等[38]在雞胚發育E3.0 d時外源注射FAD至胚胎中,最終誘導了雛雞雌性到雄性的性反轉,在反轉個體性腺中發現芳香酶活性顯著喪失并伴隨著性腺出現雄性化特征,但W染色體連鎖的HINTW、FAF和FET1基因的表達水平在雌性雞性反轉前后沒有差異,據此,提出是Z連鎖的DMRT1而不是W性染色體調控鳥類的性別分化過程。

DMRT1劑量對雞性別分化影響的最直接的證據是Ioannidis 等[26]在2021年的報道,基于CRISPR-Cas9的單等位基因靶向方法產生具有DMRT1基因靶向突變的雞,發現由此產生的具有DMRT1單一功能拷貝的染色體雄性(Z+Z-)雞發育形成卵巢,直接證明雞性別決定機制基于DMRT1劑量,結果說明了在雄性個體中,DMRT1劑量(兩個拷貝)對睪丸形成命運的決定作用,有趣的是突變雞(Z+Z-)的外形、生長速度和肌肉發育等和野生型的公雞更為相似,該結果也支持了鳥類動物的CASI假說。同年Lee 等[39]也做了相似的工作,采用CRISPR-Cas9破壞DMRT1起始密碼子,發現在雄性雞胚發育的早期階段,DMRT1的破壞誘導性腺雌性化,在激素合成紊亂的情況下,雌性的功能性生殖能力無法實現。

5 DMRT1作用途徑

有關DMRT1在性別決定和分化中如何發揮作用尚未有完善的試驗性結果,但大多數研究推測認為DMRT1主要是與FOXL2拮抗抑制雌激素通路從而調節性腺分化的進程。Snchez和Chaouiya[40]2018年依靠已發表的試驗數據組裝了一個基因網絡,形成了一個整合Z染色體劑量效應和W染色體顯性效應的假設邏輯模型 (圖3)。該模型表明,雞性腺的命運是由DMRT1和FOXL2之間存在相互抑制的關系引起的,其中DMRT1產物的初始量決定了性腺的發育。Hirst等[41]在2018年的研究中指出,性腺中表達的DMRT1可以激活睪丸發育中的SOX9、AMH和HEMGN基因,同時發現DMRT1還抑制卵巢通路基因,如FOXL2和CYP19A1,但雌性性腺中較低水平的DMRT1表達與卵巢通路的激活是可以同時發生的。Major等[42]在2019年的報道中指出,雄性雞胚性腺中FOXL2的錯誤表達會抑制睪丸發育途徑,消除雄性發育相關基因DMRT1、SOX9和AMH的局部表達的同時會抑制支持細胞發育,也驗證了FOXL2與DMRT1潛在的拮抗關系。

Z1和Z2表示任意一條Z染色體,而W表示W染色體;粗、細實線箭頭分別表示促進和抑制作用,虛線箭頭表示間接或潛在的作用

Ioannidis等[26]在2021年較為系統的闡述了DMRT1和FOXL2雌激素相關通路在調控性腺分化中的相互作用(圖4)。該研究指出,在DMRT1表達正常的Z+Z+(兩個拷貝)雞胚胎中,DMRT1抑制FOXL2的表達,進而引起芳香化酶的表達減少和雌激素合成減少,在Z+W 胚胎中,DMRT1的量不足以抑制FOXL2的表達,從而導致雌激素E2對睪丸發育通路的抑制。另有研究發現,在DMRT1基因突變的Z-W胚胎中,雖然發育形成了卵巢結構,但與Z+W相比,性腺在形態上更小且皮質層薄,不能正常進行減數分裂,這表明DMRT1的存在對于雌性性腺正常發育也是必須的;在E2合成受阻的Z+W和Z+Z-雞胚胎中,雄性相關發育通路未被抑制,發育形成了睪丸結構,同時在對照組野生型ZW胚胎的雌激素合成阻斷試驗中,性腺發育形成睪丸,但在E2合成受阻的Z-W雞胚胎中性腺髓質類似于卵巢,結果充分表明了DMRT1的劑量效應對雌性發育的影響依賴于雌激素,DMRT1在雌性個體形成卵巢的發育過程中也起到了非常重要的作用。

2x和1x表示2個拷貝和1個拷貝;虛箭頭和實箭頭分別表示雄性和雌性的作用,線寬表示作用的強弱

目前相關研究發現,DMRT1直接或間接激活雄性相關因子HEMGN、SOX9和AMH的表達[43],但其在禽睪丸發育過程中的直接轉錄靶標目前尚不清楚。DMRT1促進雄性胚胎中的睪丸發育而抑制雌性胚胎中的卵巢發育,DMRT1很可能在雞胚性腺中既能充當轉錄激活因子又能充當轉錄抑制因子,但這些還缺乏試驗性數據支持。DMRT1基因在其他物種上的研究也值得借鑒,如在幼年小鼠睪丸中,采用染色質免疫共沉淀結合高通量測序技術(CHIP-seq)和RNA表達分析測定DMRT1全基因組靶標,發現DMRT1蛋白大約能結合到1 400個近端啟動子區域,這里還包括DMRT1本身[44]。Lindeman等[45]在小鼠體內和體外細胞培養中發現,SOX9和DMRT1在顆粒細胞重編程成支持細胞中協同發揮作用,提出DMRT1可作為先驅因子開放染色質從而引起SOX9的結合。另外,Gao等[46]于2005年在斑馬魚上的研究發現,SOX5結合DMRT1啟動子并抑制其表達,指出DMRT1和SOX5之間的拮抗關系,同時也表明DMRT1在早期胚胎發生中存在潛在的轉錄調控機制;Lei等[47]在2009年對大鼠的研究發現,FOXL2通過3.2 kb/2.8 kb調控區抑制DMRT1啟動子,為顆粒細胞中的DMRT1轉錄沉默提供了潛在原因;Tang等[48]和Wei等[49]在2019年發現,DMRT1通過直接結合SOX30和SOX9B啟動子內的特異性CRE正調控羅非魚SOX30和SOX9B的轉錄。上述物種上的研究為解析DMRT1在雞等鳥類動物上復雜的分子機制提供了很好的參照。

6 DMRT1的潛在調控機制研究

6.1 miRNAs的調控

miRNAs是機體內調控基因轉錄后表達的重要途徑,miRNAs通過靶向目的基因mRNAs的3′UTR區域沉默mRNAs表達或者降解mRNAs,以達到對基因表達的抑制作用。相關研究有證據支持miRNAs在雞胚胎性腺發育中發揮作用,而關于miRNAs和DMRT1的研究提示miRNAs可作為DMRT1潛在的調控靶點。Bannister[50]使用雌激素誘導雞胚雄性性腺到雌性的反轉后,MIR202*的表達降低到正常雌性雞胚的表達水平,而用芳香酶抑制劑誘導雌性到雄性的性反轉后,MIR202*表達增加,研究還發現MIR202*表達降低與睪丸相關基因DMRT1表達減少相關,而MIR202*表達增加與FOXL2和芳香酶的下調以及DMRT1和SOX9的上調相關。結果證實,MIR202*的上調與胚胎雞性腺的睪丸分化方向一致。此外,Cutting等[51]2012年通過對性腺中miRNAs的表達分析發現一些miRNAs在性腺中表達的二態性,也提出了miRNAs能潛在調節DMRT1的表達。

Warnefors 等[52]在2017年對雌/雄雞不同組織miRNAs進行測序,研究結果發現了很多具有明顯性別偏向性表達的miRNAs,其中miR-2954-3p編碼基因位于Z染色體上,表現出雄性偏向性表達,且顯示出對雞Z染色體上劑量敏感基因的保守偏好。同時依據他們的測序結果,筆者發現gga-miR-30e-3p、gga-miR-2954-3p、gga-miR-202-3p、ggamiR-153-5p、gga-miR-6562_M2-3p、gga-miR-6562_M1-3p、gga-miR-138-2-3p和DMRT1也存在靶向關系,同時在性腺中也具有顯著的性別偏向表達,可作為后續DMRT1基因研究的潛在靶點。此外,Prastowo和Ratriyanto[53]使用3個在線數據庫(即miRDB、TargetScan和microT-CDS)挖掘靶向雞DMRT1的miRNAs,共得到78個靶向DMRT1 的3′UTR的miRNAs,在最少兩個數據庫中發現了8個miRNAs。這些研究結果提示,miRNAs在DMRT1的表達調控中發揮重要作用,但深入的機制解析還有待開展。

miRNAs作為藥物治療已經有廣泛的應用,篩選潛在作用于DMRT1基因的miRNAs可能是實現性別調控的重要手段。

6.2 雞雄性高甲基化區域(cMHM)調控

由于在雞上沒有直接證據表明Z染色體隨機失活現象的存在,但雞Z連鎖基因在雌雄個體間的平均表達差異是1∶1.4～1.8[41]而不是1∶2,這說明有相關機制起到了一定的劑量補償作用,其中雄性Z染色體上的MHM以及其附近區域的轉錄活性較低,對鄰近一些基因表達產生了一定的抑制作用,所以MHM也被認為是劑量補償效應的一個解釋。MHM 最早由Teranishi等[54]在雞Z染色體的短臂上發現,位于雞Z染色體的27.140～27.398 Mb區域內,其包含有200多個長度為2.2 kb的串聯重復序列,在雄性體內高甲基化且沒有轉錄活性,但MHM在雌性個體中低甲基化并能轉錄形成長鏈非編碼RNA(lncRNA)[54-55]覆蓋Z染色體。另外Teranishi等[54]還發現,在ZZZ三倍體細胞中,所有3個Z染色體的MHM區域都是高甲基化和無活性的,而在ZZW三倍體中,MHM區域是低甲基化并且兩個Z染色體都能轉錄,這些結果提示W染色體或許存在某些特殊的調節方式調控MHM區域的表達。

Yang等[56]在2010年為了分析MHM對性別依賴基因表達的調控作用,構建含有雞MHM的外源質粒并注射到13周齡公雞的左側睪丸中,結果發現用外源性pEGFP-N1-cMHM質粒處理的公雞睪丸中DMRT1表達下調。Roeszler等[55]在2012年的研究中發現,在胚胎階段雄性個體中的MHM的錯誤表達會導致DMRT1的表達受損;另外Caetano等[57]發現,在同一發育階段,雌性中的MHM上調而DMRT1下調,從而提出MHM可能在卵巢發育中起作用,這些結果充分表明MHM ncRNA對DMRT1存在潛在調節作用。

Sun 等[58]在2019年對雞Z染色體研究發現了兩個雄性高甲基化位點MHM1(之前報道的MHM)和MHM2,MHM1、MHM2分別位于染色體27.140～27.398 Mb和73.160～73.173 Mb區域。在雞的整個發育階段,與大多數體細胞中的Z染色體其余部分相比,位于MHM1或MHM2附近(25～32 Mb,72.5～73.5 Mb)基因的表達(指雄性∶雌性的相對表達量)會降低,筆者發現DMRT1基因剛好位于Z染色體26.45～26.50 Mb之間,其表達可能受到MHM1的影響,但Sun等[58]未在性腺組織上采樣進行比較,因此,在性腺組織中DMRT1轉錄活性是否也會受到MHM1影響還有待探索。

Shioda等[59]也報道了與之類似的表觀遺傳修飾對性腺分化的影響,其將遺傳雄性(ZZ)雞胚用外源性雌激素刺激處理后發現,在孵化時性腺暫時出現雌性化,性腺雌性化的ZZ個體在1年內被雄性化回退形成睪丸。該研究指出,性腺雌性化的ZZ個體中,可能其體細胞群和生殖細胞群都保持著遺傳性別的轉錄組和表觀遺傳記憶。這種表觀遺傳記憶是否與DMRT1基因功能有關也還需進一步研究。

7 結論與展望

從對雞DMRT1基因的研究進展來看,DMRT1基因劑量直接影響雞的性別決定。值得注意的是,目前所認為的DMRT1基因在性別決定中發揮作用的途徑主要是抑制雌激素通路,而有關DMRT1的上游調控機制目前還沒有系統完整的研究。因此,完善DMRT1基因在雞等鳥類動物中所參與到的生物學通路具有重要意義。

另外有兩篇重要的報道:一是Ayers等[60]在2013年通過分析雞胚性分化之前的E12 h胚盤和E4.5 d胚胎性腺中基因表達譜,發現這兩個階段的組織中,很多已知的性別相關基因和一些常染色體上基因已經出現了強烈的性二態基因表達,因此提出在表型可見的雞胚性別分化之前分子水平已開啟了性別分化;二是Ichikawa等[61]在2022年的報道中提出性別決定在雌性中似乎比在雄性中更早發生。上述研究結果讓研究者們對細胞命運有了更深層次的認知,而且后者的觀點與現有的有關DMRT1抑制雌激素相關通路發揮作用的方式十分吻合,同時也暗示著在雞等鳥類生物中,雌性發育的優先級更高。

DMRT1所處的復雜調控狀態提示我們思考劑量表達的重要性以及機體為何要采取如此復雜的程序調控基因表達,如何實現如此精準的調控?雌性雞為何會發生一側性腺的退化?這注定不會是隨機事件,因為總是右側性腺退化,機體又是如何精準的控制不會發生錯誤的性腺退化?這些都有待后續研究進行補充。

在生產中,對雞胚進行早期性別鑒定,甚至于能夠實現只產雌性胚胎或者雄性胚胎,將節省大量的時間和人工成本,這無疑是家禽業發展的歷史性革命,因此以DMRT1基因作為切入點,系統深入地研究雞性別決定機制、描繪完整的性別分化圖譜以及各環節基因間的調控關系有重要的研究意義和生產價值。