近十年PCR技術在寄生蟲病診斷中的應用

楊富升,古小彬

(四川農業大學動物醫學院,成都 611130)

寄生蟲病是威脅全球動物養殖業的一類重要疾病,可引起動物生產性能降低,造成動物生長發育受阻甚至死亡,給養殖業帶來巨大的經濟損失,同時有些寄生蟲病還可感染人類,引起公共衛生問題。利用可靠的檢測技術準確診斷寄生蟲病是制定針對性防控措施的前提,對有效防控寄生蟲疾病具有重大意義[1]。

目前,多數寄生蟲病的診斷是依靠顯微鏡檢測法,該方法常作為寄生蟲病的診“金標準”,但顯微鏡檢測法對于蟲體形態學特征不明顯、感染早期蟲體數量較少而呈現亞臨床癥狀的病例極易漏檢[2],而這些漏檢病例常成為動物群體寄生蟲病傳播的重要隱形傳染源,所以需要可靠的檢測技術在寄生蟲病大量傳播前進行及時準確的診斷。聚合酶鏈式反應技術(PCR)作為現代分子生物技術,具有操作簡單、特異性強、靈敏性高等優點,能較好地解決傳統顯微鏡檢測法易漏檢早期感染病例的“卡脖子”問題[3]。選擇合適的靶基因設計引物能提高檢測的特異性,對PCR檢測也至關重要。隨著核酸技術的成熟和寄生蟲基因組序列的深入研究,PCR檢測方法在寄生蟲病的診斷上發揮著越來越重要的作用,給寄生蟲病的有效防控提供技術支持。因此,本文針對近十年(2012—2022)PCR技術在寄生蟲病診斷上的應用和相關報道進行綜述。

1 常用PCR檢測技術

近十年內,用于寄生蟲病診斷的常用PCR技術包括常規PCR、巢氏PCR、多重PCR、熒光定量PCR和數字PCR等(表1)。

表1 近十年各類PCR技術在寄生蟲病診斷中的應用

1.1 常規PCR

常規PCR通過外部合成寄生蟲特異性DNA片段,再經電泳檢測是否含有該目的條帶,從而判斷檢測樣品的陽性或陰性。

研究發現,利什曼原蟲、類圓線蟲和布氏錐蟲的常規PCR方法靈敏度高于傳統鏡檢法,但該方法的檢出率會因靶基因不同而存在差異。皮膚型利什曼原蟲的常規HSP20-PCR(熱休克蛋白基因)最低可檢測到10 fg蟲體DNA,靈敏度高于顯微鏡檢測法[4];kDNA-PCR(動基體基因)和ITS-1-PCR證實了上述觀點,這兩種方法對疑似患病皮膚樣品的檢出率均高于顯微鏡檢測法(kDNA-PCR:98.7%;ITS-1-PCR:91%;鏡檢:74.4%)[5];內臟型利什曼原蟲kDNA-PCR檢測也得到類似結論,該方法的檢出率(67%)明顯優于顯微鏡檢測法(54%)[6]。應用于馬場的普通類圓線蟲ITS-2-PCR檢測方法明顯優于傳統培養檢測,且適合大量樣本的檢測[7]。布氏錐蟲mtDNA-PCR檢測方法在血液中最低可檢測出蟲體1個·mL-1,具有較好的重復性[8]。然而,在一項皮膚型利什曼原蟲的檢測中得到了相反的結論,該研究中的kDNA-PCR方法的檢出率(56.2%)低于顯微鏡檢測法(76.2%)[9]。除此之外,近十年內還有研究者建立常規PCR方法用于貓胞裂蟲[10]、疥螨[11]、賈第鞭毛蟲[12]、曼氏血吸蟲[13]等的診斷,但未與其他檢測方法進行比較。

綜上,常規PCR的靈敏度常高于顯微鏡檢測法,然而常規PCR無法進行定量檢測和多種寄生蟲的混合感染檢測等,因此,研究者們利用常規PCR衍生出的其他PCR技術對寄生蟲病進行更深入的檢測。

1.2 巢氏PCR

為提高PCR擴增的特異性和靈敏度,研究者發明了巢式PCR(nested PCR,nPCR)。nPCR是指利用外引物和內引物依次進行PCR擴增,將兩次特異性擴增后的最終產物進行電泳檢測。

瘧原蟲、牛巴貝斯蟲和利什曼原蟲的nPCR診斷方法的檢測靈敏度高于傳統鏡檢法,適用于低荷蟲數樣品的檢測。瘧原蟲的顯微鏡檢測法對蟲體的最低檢測限度約20個·μL-1,而間日瘧原蟲18SrRNA-nPCR對蟲體的最低檢測限度達到了6個·μL-1[14],優化后甚至可達0.2個·μL-1[15],在惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲的nPCR檢測限度亦被證實高于鏡檢法[16-19]。牛巴貝斯蟲18SrRNA-nPCR對臨床血樣的整體檢出率(54.4%)高于顯微鏡檢測法(20.4%)[20];利什曼原蟲kDNA-nPCR對隱形感染樣本的檢出率(79%)高于顯微鏡檢測法(58%)[21]。蝦肝腸胞蟲、眼部弓形蟲和利什曼原蟲的nPCR方法的檢測靈敏高于常規PCR,其中蝦肝腸胞蟲β-tubulin-nPCR的靈敏度較常規PCR方法提高100倍[22],眼部弓形蟲B1-nPCR檢出率較常規PCR提高30%[23],利什曼原蟲ITS-1-nPCR可檢出常規PCR為“假陰性”的樣品[24]。研究還發現,nPCR方法比免疫組化和免疫色譜法更靈敏。利什曼原蟲kDNA-nPCR對顯性感染樣本的檢出率(100%)高于免疫組化方法(97%),而兩種方法對隱性感染樣本的檢出率相當(均為94%)[25];瘧原蟲18SrRNA-nPCR對隱形感染者的檢測比快速免疫色譜法更有效[26]。此外,nPCR還被用于馬泰勒蟲[27]、肝片吸蟲[28]等的流行病學調查。

綜上,nPCR較常規PCR、顯微鏡檢測法等有更高的靈敏度,適用于檢測低荷蟲數的樣品,也可以作為流行病學調查的工具。

1.3 多重PCR

相較于常規PCR,多重PCR(multiplex PCR,mPCR)是在反應體系中加入1對以上引物,最終擴增出多條DNA片段進行檢測,適合用于診斷多種寄生蟲的混合感染。

瘧原蟲等原蟲和美洲板口線蟲等土源性線蟲的mPCR靈敏度高于傳統“金標準”方法(顯微鏡檢測法、福爾馬林乙酸乙酯濃集法等)。cox3-mPCR對卡氏住白細胞蟲、沙氏住白細胞蟲、并核瘧原蟲和雞瘧原蟲的最低檢測限度分別為105、105、106、107copies·μL-1,該方法對臨床樣品的檢出率高于顯微鏡檢測法[29];然而在瘧原蟲屬、住白細胞蟲屬、變形血原蟲屬等混合感染樣品的檢測中得到不同的結論,在檢測其中1個混合感染的樣品時,顯微鏡檢測法檢測出了混合感染樣品的所有蟲種,而Cytb-mPCR未檢出瘧原蟲屬[30]。以人蛔蟲的ITS-1基因、美洲板口線蟲和糞類圓線蟲18SrRNA基因建立的mPCR對混合感染樣品的最低檢測限度均為1 pg蟲體DNA,其檢測靈敏度是福爾馬林乙酸乙酯濃集法的5倍[31]。另外,mPCR較其他PCR方法的靈敏度在不同寄生蟲中存在差異。Cytb-mPCR對瘧原蟲屬、住白細胞蟲屬、變形血原蟲屬等混合感染樣品的總體檢出率(52.7%)高于Cytb-nPCR(48.8%)[30];cox1-mPCR對卡普拉瘧原蟲、呂氏泰勒蟲和羊巴貝斯蟲的靈敏度與常規PCR一致[32];而羊泰勒蟲和無漿體18SrRNA-mPCR對泰勒蟲的最低檢測限度(29.4×10-3ng·μL-1)低于18SrRNA-PCR(29.4×10-6ng·μL-1)[33],類似的結果在以環形泰勒蟲Cytb基因和瑟根泰勒蟲ITS-1基因的mPCR方法中得到證實,該方法對瑟根泰勒蟲的最低檢測限度(10-7ng·μL-1)低于常規PCR(10-8ng·μL-1)[34],造成上述差異的原因可能與mPCR體系中多對引物之間的影響有關。近十年內,mPCR方法還用于雞異刺線蟲、貝拉異刺線蟲和印度異刺線蟲的混合檢測[35],東方次睪吸蟲和華支睪吸蟲的混合檢測[36]。

綜上,mPCR可用于多種寄生蟲混合感染的診斷,該方法對于引物和反應條件的設計上較常規PCR更加嚴格,否則會產生非特異性條帶或產生的條帶不能準確區分蟲種,也會影響該方法的靈敏性。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團,通過檢測熒光基團在擴增中的熒光信號發射情況,在一定范圍內定量分析樣本中的基因含量。

巴貝斯蟲、利什曼原蟲和派琴蟲qPCR的靈敏度高于傳統顯微鏡檢法和巰基醋酸鹽培養基檢測。微小巴貝斯蟲18SrRNA-qPCR檢測靈敏度是染色鏡檢的20倍[37];利什曼原蟲ITS-1-qPCR可以定量檢測所有的急性與慢性病例的寄生蟲荷蟲量,而顯微鏡檢測法只能對其中部分樣品中進行定量檢測[38];kDNA-qPCR對內臟型利什曼原蟲顯性、隱形感染病例以及嬰兒利什曼原蟲感染病例的檢出率均高于顯微鏡檢法[6,39],派琴蟲ITS-1-qPCR最低檢測限度(1個蟲體)遠高于標準方法——巰基醋酸鹽培養基檢測(RFTM,>1 000個蟲體),且在臨床樣本檢測中亦發現其檢出率(82.22%)高于RFTM(57.5%)[40]。另外,在其他寄生蟲的qPCR檢測中證實其靈敏度高于常規PCR、nPCR。kDNA-qPCR在嬰兒利什曼原蟲感染病例的檢出率高于ITS-1-PCR[39];包拉米蟲和馬爾太蟲18SrRNA-qPCR可檢測出稀釋至10 copies·μL-1的標準樣品,其臨床樣品的檢出率(87.2%)高于ITS-1-PCR(60.7%)[41];微小孢子蟲18SrRNA-qPCR最低檢測限度(0.1個卵囊)明顯高于18SrRNA-nPCR的檢測限度(100個卵囊)[42]。然而,在一項曼氏血吸蟲的檢測中卻發現121 bp-qPCR對低荷蟲數感染人群的檢出率與其標準檢測方法(改良加藤厚涂片法)相當[43],亦有發現kDNA-qPCR對嬰兒利什曼原蟲的檢出率略低于直接凝集實驗(direct agglutination test,DAT),不過DAT方法無法區分既往感染和現癥感染[6]。此外,需要注意的是qPCR只能在一定范圍內定量檢測,多房棘球絳蟲和加拿大棘球絳蟲qPCR方法的最低檢測限度分別為2×10-5、2×10-4ng·μL-1濃度的DNA,超過該限度只能定性檢測[44]。qPCR反應中探針類型對檢測結果也有一定影響。在皮膚利什曼原蟲和黏膜利什曼原蟲的qPCR檢測中,以SYBRGreen為探針的kDNA-qPCR的檢出率均高于TaqMan探針[45],不過使用TaqMan探針能同時對多個寄生蟲的混合感染進行定量檢測,通常應用于原蟲混合感染和蠕蟲混合感染的流行病學調查[46-48]。近十年內qPCR還被報道用于克氏錐蟲[49]、隱孢子蟲[50]、惡性瘧原蟲[51]等的檢測。

綜上,qPCR的檢出率通常高于傳統的標準方法,且能夠在一定范圍內準確的檢測出待檢樣品中的寄生蟲含量,但檢測結果受到探針和樣本類型的影響。

1.5 數字PCR

數字PCR(digital PCR,dPCR)是一種新型PCR技術,其原理是將整體反應體系分解成大量反應單元進行PCR擴增,最終通過統計學分析,計算出原始DNA濃度。

研究發現,dPCR檢測靈敏度高于顯微鏡檢測法,可檢出寄生蟲的隱形和早期感染。巴貝斯蟲ITS-1-dPCR最低檢測下限是10 copies·μL-1,能檢測出鏡檢呈陰性的低荷蟲數樣本,該方法適用于檢測巴貝斯蟲的隱性感染[52]。dPCR也可檢出小鼠日本血吸蟲的早期感染[53-55],SjR2-dPCR最低可以檢測到0.05 fg蟲體DNA,遠遠低于1對成蟲(約3 000 ng)或1個卵(約50 pg)的DNA含量[53]。人蛔蟲卵的檢測發現dPCR較qPCR具有更高的靈敏度,在相同的待檢樣品中,ITS-1-dPCR方法檢出的人蛔蟲卵DNA量大于qPCR的檢出量(ITS-1-dPCR:5個蟲卵DNA量;ITS-1-qPCR:1個蟲卵DNA量)[56]。然而針對糞便中隱孢子蟲的檢測時,卻得出相反的結果,其18SrRNA-dPCR的檢測效果不如18SrRNA-qPCR,前者對陽性糞便中不同濃度隱孢子蟲的DNA拷貝數始終低于qPCR,且隨著DNA濃度降低,dPCR的精準度降低,而18SrRNA-qPCR定量檢測卻不受DNA濃度的影響[50],類似的結果在慢性錐蟲病的檢測中亦得到證實[49]。

綜上,dPCR可用于低荷蟲數的定量檢測,靈敏度會因檢測對象不同而存在差異。對比qPCR的相對定量,dPCR不需要參考基因及建立標準曲線,是一種絕對定量檢測,但是dPCR技術成本較高、操作復雜,尚未得到廣泛應用和推廣。

2 常用分子靶基因

近十年內,已報道用于寄生蟲病診斷的常用分子靶標包括核糖體基因、線粒體基因、蛋白編碼基因和其他高拷貝的基因(表2)。

表2 近十年各類靶基因在寄生蟲病PCR診斷中的應用

2.1 核糖體基因

核糖體基因(ribosomal DNA,rDNA)與核糖體蛋白形成核糖體,其中18SrRNA、28SrRNA、ITS-1、ITS-2等基因常作為靶基因應用到PCR檢測中。

近十年,以18SrRNA基因建立了檢測賈第鞭毛蟲、包拉米蟲、馬爾太蟲、泰勒蟲、巴貝斯蟲、瘧原蟲等的PCR方法,被證實18SrRNA基因具有良好的特異性。以該基因設計引物檢測賈第鞭毛蟲,其特異性片段大小為130 bp,發現在相同類型的PCR方法中,18SrRNA基因的檢出率(100%)高于磷酸丙糖異構酶(TPI)基因(92.6%)[12];在檢測包拉米蟲和馬爾太蟲時,該基因引物產生的特異性條帶大小分別為118、199 bp,對牡蠣其他常見寄生蟲的DNA檢測結果為陰性[41];在檢測環形泰勒蟲、分離泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲等時,產生的特異性條帶在298 bp左右,特異性良好,不會與吉氏巴貝斯蟲、立克次氏體等產生反應[33];在微小巴貝斯蟲中產生的特異性片段長238 bp,對雙芽巴貝斯蟲、駑巴貝斯蟲、分離巴貝斯蟲和惡性瘧原蟲等檢測結果為陰性[37];在多種瘧原蟲中以18SrRNA靶基因建立了多種PCR檢測方法,擴增出的片段約為157～165 bp,對利什曼原蟲、巴貝斯蟲和弓形蟲等檢測結果為陰性[57],還可通過18SrRNA靶基因同時鑒別惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲,它們所擴增的條帶大小分別為250、120、144、800 bp[16-18]。近十年內18SrRNA還用做檢測美洲板口線蟲[31]、糞類圓線蟲[31]、隱孢子蟲[42]、貓胞裂蟲[10]等的靶基因。

近十年,ITS靶基因已用于利什曼原蟲、異刺線蟲、肝片吸蟲、奧爾森派琴蟲的PCR診斷。以利什曼原蟲的ITS-1基因設計了多種特異性引物,在皮膚型利什曼原蟲中產生的ITS-1特異性條帶大小在300～350 bp[24],而內臟型利什曼原蟲的特異性條帶為360[6]和100 bp[58];ITS-2在檢測不同種類的異刺線蟲時產生的特異性條帶大小不同,雞異刺線蟲為396 bp、貝拉異刺線蟲為272 bp、印度異刺線蟲為482 bp,它們的引物不會與雞蛔蟲、孟氏尖旋線蟲、回飾帶線蟲、唇飾帶線蟲等寄生蟲產生反應[35];以肝片吸蟲ITS-2設計引物得到的條帶大小為208 bp,其引物特異性強,對同盤吸蟲、華支睪吸蟲、東畢吸蟲等蟲體DNA檢測為陰性[28]。除單獨使用ITS-1、ITS-2基因外,還可將兩種基因聯合建立PCR診斷方法,其可有效檢測組織中的奧爾森派琴蟲,該方法特異性強,不會在其他類型的派琴蟲中擴增出特異性片段[40]。近十年內ITS還用作檢測人蛔蟲[31]、瑟根泰勒蟲[34]、微小巴貝斯蟲[52]、鄧肯巴貝斯蟲[52]等的靶基因。

與上述核糖體基因相比,28SrRNA基因在寄生蟲PCR檢測的研究相對較少。以枯氏住肉孢子蟲的檢測中,該引物產生的特異性條帶為580 bp,該基因在同為常規PCR方法的檢測中最低檢測限度(0.01 ng·μL-1)高于cox1靶基因(1 ng·μL-1),然而該基因的引物特異性不強,可從剛地弓形蟲、微小孢子蟲、歐猥迭宮絳蟲中擴增到雜條帶,無法很好地區分上述寄生蟲[59]。

2.2 線粒體基因

線粒體DNA(mtDNA)存在于線粒體中,其中包括細胞色素b基因(Cytb)、細胞色素c氧化酶基因(cox)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶基因(nad)和16SrRNA,上述基因常被用做分子靶標應用到寄生蟲的PCR檢測中。

Cytb基因已用于細粒棘球絳蟲和環形泰勒蟲的檢測。其中以細粒棘球絳蟲Cytb基因設計引物產生的條帶為121 bp[60],引物對肝片吸蟲、莫尼茨絳蟲DNA檢測的結果都為陰性;在環形泰勒蟲的檢測中,擴增出的條帶大小為393 bp,不會與雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、中華泰勒蟲等產生反應[34]。cox1基因已用于犬惡絲蟲、疥螨、卡普拉瘧原蟲、呂氏泰勒蟲、巴貝斯蟲、枯孢子蟲的檢測中,具有良好的特異性。在犬惡絲蟲的檢測時擴增出的特異性條帶大小為502 bp,在陰性血清樣本中不會出現目的條帶[25];檢測疥螨所擴增的cox1特異性條帶大小為121 bp,對于癢螨、蠕形螨和金黃色葡萄球菌等病原DNA檢測為陰性[11];對于卡普拉瘧原蟲、呂氏泰勒蟲和巴貝斯蟲,特異性引物產生的片段大小分別是320、664、555 bp,引物之間不會產生非特異性條帶,與無漿體、錐氏蟲屬等不會產生反應[32]。cox3基因已用于貓胞裂蟲(252 bp)和沙氏住白細胞蟲(294 bp)的檢測,在同為常規PCR的檢測中,貓胞裂蟲cox3基因在早期感染病例檢測中的敏感度高于18SrRNA[10],而在沙氏住白細胞蟲的檢測中,發現cox3基因的敏感性低于Cytb基因[61]。以16SrRNA為靶基因建立了檢測疥螨的多種PCR方法,產生的特異性條帶大小為135 bp,兩種方法中引物都不會與癢螨、耳螨等蟲體DNA產生反應[62]。以線粒體基因nad6建立了檢測細粒棘球絳蟲的PCR方法,產生的特異性條帶為558 bp,對多房棘球絳蟲、孟氏迭宮絳蟲、犬復孔絳蟲、多頭帶絳蟲及犬弓首蛔等蟲體DNA為陰性[63]。除使用單個線粒體基因外,還可聯合2種線粒體基因設計引物檢測蟲體。以多房棘球絳蟲nad基因(126 bp)和加拿大棘球絳蟲cox1基因(143 bp)建立了檢測上述兩者蟲體的mPCR檢測方法[44];以及東方次睪吸蟲nad1基因(508 bp)和華支睪吸蟲nad5基因(311 bp)建立了mPCR檢測方法,兩對引物不會與鴨對體吸蟲、橫川后殖吸蟲和卷棘口吸蟲產生反應[36]。除上述線粒體基因外,還可用線粒體上的其他基因序列,如以位于線粒體非編碼區和cytb5′末端之間的序列、線粒體DNA的非編碼區之間的序列設計引物建立瘧原蟲屬、變形血原蟲屬等的PCR診斷方法[30]。

2.3 蛋白編碼基因

除上述核糖體基因和線粒體基因外,一些編碼特定功能蛋白的基因也能作為靶基因。這類基因相對保守,在染色體上的拷貝數較多,它們的功能包括協助寄生蟲運動、維持寄生蟲形態、使寄生蟲逃逸宿主免疫功能。近十年內已被報道用于寄生蟲PCR診斷的蛋白編碼基因有β-微管蛋白基因、紅細胞膜蛋白1基因(EMP1)、精氨酸轉運蛋白基因(AAP3)、熱休克蛋白基因(HSP)、磷酸丙糖異構酶(TPI)基因、頂膜抗原基因(AMA-1)、伴侶素基因(CCT)等。

以β-微管蛋白基因為靶基因檢測蝦肝腸胞蟲,產生的特異性條帶237 bp,該引物特異性強,對該蟲的多種宿主DNA檢測為陰性[22]。有研究發現惡性瘧原蟲的EMP1基因豐度顯著高于18SrRNA基因,以EMP1基因設計引物得到的目的條帶為260 bp,結果也顯示該基因在PCR檢測中的敏感性高于18SrRNA[51]。以AAP3基因為靶基因檢測環孢子蟲,擴增出的目的條帶大小為74 bp,該方法對布氏錐蟲、克氏錐蟲、人或小鼠的DNA的檢測為陰性,具有良好的特異性[64]。以TPI基因為靶基因檢測賈第鞭毛蟲,產生的特異性條帶大小為530 bp,在同類型的PCR方法中,該基因在同一批樣本的檢出率低于18SrRNA基因[12]。以利什曼原蟲HSP20基因分別設計了長為107和370 bp的兩種引物檢測該蟲,發現前者的靈敏度高于后者[4];以利什曼原蟲HSP70基因設計的引物產生的條帶大小為1 422 bp,在同類型的PCR檢測中,對同一批樣本的檢出率低于18SrRNA基因[65]。研究發現在利什曼原蟲中HSP基因的拷貝數相對較少,所以HSP為靶基因的PCR檢測中效果不如18SrRNA、ITS-1、ITS-2基因等[66]。在牛卵形巴貝斯蟲的PCR檢測中發現蛋白編碼基因AMA-1基因和CCT基因的敏感性不如18SrRNA基因,其臨床樣本的檢出率低[67]。

2.4 其他基因序列

除上述基因外,近十年內還用于寄生蟲PCR診斷的靶基因還包括其他的一些高拷貝數基因,比如日本血吸蟲SjR2、曼氏血吸蟲121 bp高度重復序列、利什曼原蟲的動基體基因kDNA、瘧原蟲的Pvr47和Pf364、弓形蟲的B1和529 bp的高度重復序列等。

以日本血吸蟲的逆轉錄座子SjR2為靶基因建立了兩種PCR方法,在常規PCR中的引物擴增的片段大小為191 bp,不會與曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲等產生反應[53];在qPCR中的引物擴增的片段大小為230 bp,不會與華支睪吸蟲、衛氏并殖吸蟲產生反應[68]。以曼氏血吸蟲全基因組中的一段高度重復序列“121 bp”建立了多種PCR檢測方法[13,69-70],在同類型的PCR方法中,該基因的敏感度比線粒體基因nad5、核糖體基因28SrRNA高[71]。動基體基因kDNA是利什曼原蟲診斷中敏感性高、特異性強的靶基因序列[46,72],以該基因設計的引物產生的條帶為100～150 bp[9,21,39,73-77],在同類型的PCR方法下,該基因的敏感性均高于ITS-1基因、18SrRNA基因[39,78]。間日瘧原蟲的高拷貝數基因Pvr47和惡性瘧原蟲的高拷貝數基因Pf364也常作為靶基因建立了多種PCR檢測方法,產生的特異性條帶分別為104、88 bp,在同類型PCR方法下,Pvr47、Pf364基因較18SrRNA基因更靈敏[79-83]。在弓形蟲的全基因組中,以B1基因(193 bp)和一段高度重復序列529 bp設計引物建立PCR方法,對利什曼原蟲屬、瘧原蟲屬、細粒棘球蚴、阿米巴原蟲和人類染色體 DNA檢測為陰性[84-87]。

3 展 望

寄生蟲病的傳統診斷方法在形態相似的蟲體樣本和亞臨床病癥樣本的診斷上不如PCR快速準確。隨PCR技術日漸成熟,已衍生出多種PCR檢測方法,如nPCR、mPCR、qPCR、dPCR等,這些方法部分已經廣泛應用于多種寄生蟲病的檢測,在實際使用中可結合經濟條件、試驗條件、研究策略等合理選擇適宜的PCR檢測方法。另外,PCR方法也有待改進的地方,如進一步提高檢測的特異性、準確性和敏感性、減少試驗過程中的污染、減少實際應用的成本投入等。PCR診斷方法的準確性與靶基因的選擇密不可分,現核糖體基因、線粒體基因、編碼蛋白基因以及其他特有的高拷貝數基因等靶基因已被廣泛應用于寄生蟲病的PCR檢測,但不同的寄生蟲病所適用的靶基因不同,而隨組學技術的發展,可挖掘更多的靶基因來提高PCR技術的準確性,因此,未來還需要更多的研究來確定檢測各類寄生蟲的最優特異性靶基因。