牛支原體黏附素及黏附素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展

武 琪,張玉娟,劉 桐,辛九慶,徐青元

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150069)

牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)又稱牛霉形體,屬于原核生物界軟壁菌門柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬,無(wú)細(xì)胞壁,基因組大小約為1 080 kb。M.bovis最早于1961年在美國(guó)患有乳腺炎奶牛的牛乳中分離到[1],20世紀(jì)90年代,在歐洲和北美牛場(chǎng)流行。2008年,辛九慶等[2]首次從我國(guó)患肺炎的犢牛肺中分離到M.bovis,隨后湖北甘肅等地相繼出現(xiàn)M.bovis感染病例[3-4]。易感動(dòng)物主要通過(guò)呼吸道、乳頭管或生殖道感染M.bovis,帶菌精液的人工授精也是一種常見(jiàn)的傳播途經(jīng)[5]。M.bovis可侵襲牛的肺、乳腺、關(guān)節(jié)、角膜、生殖道等器官,進(jìn)而引起感染牛出現(xiàn)肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎和生殖道炎等臨床癥狀,并且不同年齡不同品種牛均可感染[6]。M.bovis與某些病原體還存在協(xié)同作用,常導(dǎo)致混合感染,如溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌、化膿隱秘桿菌[7]以及牛呼吸道合胞病毒、副流感3型病毒、腺病毒、牛病毒性腹瀉病毒及牛傳染性鼻氣管炎病毒[7-8]。從M.bovis首次分離至今雖已過(guò)去數(shù)十年,但是由于存在缺乏基因組操作方法和昂貴的動(dòng)物模型等不利因素,導(dǎo)致其診斷、治療和疫苗的研究進(jìn)展緩慢,此外,雖然有許多關(guān)于M.bovis體內(nèi)和體外感染研究,但對(duì)牛支原體的致病機(jī)制仍知之甚少。M.bovis通過(guò)黏附素結(jié)合于宿主細(xì)胞,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主組織的定植和感染,其致病性與其黏附能力密切相關(guān)。因此本文主要對(duì)M.bovis黏附素和黏附素結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為M.bovis致病及免疫逃逸機(jī)制和今后M.bovis已知未知黏附素的鑒定和應(yīng)用提供參考。

1 M.bovis與宿主細(xì)胞的黏附

M.bovis感染的第一步是在宿主體內(nèi)定植,而黏附于特定的靶細(xì)胞是定植的前提,因此黏附是M.bovis感染的關(guān)鍵步驟。與肺炎支原體和生殖道支原體不同,M.bovis沒(méi)有行使黏附功能的特殊細(xì)胞器,但M.bovis可以表達(dá)具有黏附功能的膜蛋白介導(dǎo)其與宿主之間的黏附并在調(diào)節(jié)宿主防御方面發(fā)揮重要作用,包括炎癥因子的產(chǎn)生和免疫細(xì)胞的凋亡[7,9-10]。此外,M.bovis的一些代謝物如核酸酶、過(guò)氧化氫也可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[11]。這些對(duì)宿主造成的損傷都與黏附蛋白在病理生理過(guò)程中發(fā)揮的作用密切相關(guān)。M.bovis雖然主要感染牛,但對(duì)綿羊[12]、山羊[13]、豬[14]、鹿[15]和人類[16]的感染也有報(bào)道,現(xiàn)已從感染牛的呼吸道、乳房、關(guān)節(jié)、心、大腦等多個(gè)器官分離到M.bovis[17-18]。M.bovis還能黏附多種類型的宿主細(xì)胞包括胎牛肺細(xì)胞(EBL)、牛腎細(xì)胞(MDBK)、兔腎細(xì)胞(RK)和胚胎牛氣管細(xì)胞(EBTr)[19],M.bovis對(duì)不同細(xì)胞的黏附導(dǎo)致病原體向不同定植點(diǎn)傳播可能是其多種臨床表現(xiàn)的原因,同時(shí)也可能與其逃避免疫系統(tǒng)殺傷以及削弱抗生素的治療效果相關(guān)。這種M.bovis感染多種動(dòng)物、組織和細(xì)胞的現(xiàn)象表明,M.bovis的黏附素可能是復(fù)雜多樣的。當(dāng)前M.bovis的疫苗產(chǎn)品和M.bovis的檢測(cè)方法還有很大的改進(jìn)空間,而且M.bovis非常容易產(chǎn)生耐藥性,致使M.bovis疾病的預(yù)防、控制和清除均非常困難[20]。考慮到黏附素在M.bovis感染和致病方面的重要作用,理論上可將其做為疫苗的候選成分。此外,許多黏附素具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性,具備建立血清學(xué)檢測(cè)方法的潛力。

2 M.bovis黏附素

迄今為止,已鑒定出16種蛋白參與M.bovis的黏附(表1)。其中7種黏附素具有明確的宿主結(jié)合蛋白,3種黏附素可以與兩種不同的宿主蛋白相互作用(圖1),4種黏附素除了具有結(jié)合功能外,還具有酶活性。以下將對(duì)這些黏附素的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、以及部分生物學(xué)特性進(jìn)行詳細(xì)的闡述,以期為M.bovis黏附蛋白的研究與應(yīng)用提供思路。

表1 M.bovis黏附素信息匯總

圖1 M.bovis黏附素與黏附素結(jié)合蛋白互作

2.1 NADH氧化酶

NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)黏附素包含454個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為49 ku,無(wú)信號(hào)肽或跨膜區(qū),分布于M.bovis的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。有些細(xì)菌如肺炎鏈球菌的NOX具有黏附活性并且該蛋白高度保守[21]。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)M.bovis基因組中存在nox基因的同源物,因此推測(cè)該同源物可能是M.bovis的黏附素并且具有酶活性。分析發(fā)現(xiàn)M.bovis的nox基因與肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌基因相似性分別為39%和42%。研究證實(shí)原核重組NOX(rNOX)能與EBL細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合,并與膜蛋白的結(jié)合強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)蛋白。此外,rNOX能催化NADH為NAD+同時(shí)產(chǎn)生H2O2,其催化位點(diǎn)和黏附位點(diǎn)相互獨(dú)立。rNOX蛋白和抗rNOX血清均能阻斷M.bovis對(duì)EBL細(xì)胞的黏附。與野生型菌株相比,NOX蛋白缺陷菌的黏附性和過(guò)氧化氫產(chǎn)量下降。包世俊等[23]還發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)體存在下NOX黏附素抗體對(duì)M.bovis的殺菌率高達(dá)57.86%。Zhao等[22]用rNOX包被ELISA板篩選人肺cDNA文庫(kù)的T7噬菌體證實(shí)rNOX可以特異性地黏附在APLP-2和FN上。

2.2 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)是糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶[24],這種酶催化果糖-1,6-二磷酸可逆轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸和磷酸二羥基丙酮。除能量代謝外,FBA還具有許多生物學(xué)功能,包括作為Plg結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、抗真菌劑的靶標(biāo)和參與宿主細(xì)胞黏附[25-29]。Huang等[30]和Gao等[31]對(duì)M.bovis的FBA進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該蛋白是M.bovis的黏附素,并證實(shí)了該黏附素的結(jié)合蛋白為FN和Plg。M.bovis的FBA黏附素包含291個(gè)氨基酸,Mr為34 ku,無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū),分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中,具有免疫原性。FBA在支原體中高度保守,M.bovis不同菌株中的FBA相似性高達(dá)99%,與其它支原體的相似性高達(dá)60%。原核表達(dá)的重組M.bovisFBA(rMbFBA)能將NADH轉(zhuǎn)化為NAD+,兔抗rMbFBA血清在補(bǔ)體存在下可殺死44.1%的M.bovis,rMbFBA抗體可阻斷34.4%的M.bovis對(duì)EBL細(xì)胞的黏附。

2.3 M.bovis纖維連接蛋白結(jié)合脂蛋白

Adamu等[32]在研究支原體脂蛋白的生化作用時(shí),通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)(leucine-rich repeat,LRR)的脂蛋白可能具有黏附活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該蛋白由mbfN基因編碼,該基因位于M.bovisPG45菌株核苷酸654 047和655 885之間。完整的LRR蛋白包含612個(gè)氨基酸,Mr為96 ku,等電點(diǎn)為8.98,有信號(hào)肽無(wú)跨膜區(qū),主要分布于M.bovis細(xì)胞膜表面,具有免疫原性。LRR黏附素的226―284殘基中存在一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1(GIT1)樣結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在真核生物的細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架重塑和跨膜運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。LRR蛋白具有完整蛋白和C端147個(gè)氨基酸缺失兩種形態(tài),具體表現(xiàn)為蛋白質(zhì)電泳中呈現(xiàn)出70和48 ku兩種條帶。由于該LRR蛋白是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與FN結(jié)合的M.bovis脂蛋白,因此被命名為M.bovis纖維連接蛋白結(jié)合脂蛋白(M.bovisfibronectin-binding lipoprotein,MbfN)。重組MbfN (rMbfN) 與FN的結(jié)合呈劑量依賴性,在一定濃度下可達(dá)到飽和黏附,抗rMbfN蛋白抗體可特異性阻斷該反應(yīng)。與野生型菌株P(guān)G45相比,被轉(zhuǎn)座子破壞MbfN開放閱讀框的突變菌株黏附能力顯著降低,且抗rMbfN抗體可顯著降低M.bovis對(duì)MDBK細(xì)胞的黏附。體外結(jié)合試驗(yàn)表明該蛋白還可以結(jié)合HS。

2.4 α-烯醇酶

Song等[33]發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌中存在α-烯醇酶(α-enolase),這種酶的存在與細(xì)菌和宿主細(xì)胞的黏附密切相關(guān),但是這種現(xiàn)象尚未在M.bovis中得到證實(shí)。該團(tuán)隊(duì)分析發(fā)現(xiàn)M.bovis湖北株中存在α-烯醇酶的編碼基因,該基因編碼454個(gè)氨基酸,蛋白Mr為49.369 ku,等電點(diǎn)為5.27,無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。M.bovis湖北株的α-烯醇化酶與其他支原體物種的相似性可超過(guò)90%,是一種高度保守的蛋白。該蛋白包含典型的Plg結(jié)合基序,包括賴氨酸作為C端殘基(FYNIK)和保守的帶正電荷富賴氨酸內(nèi)部基序(LYDENSKKY)。進(jìn)一步研究證實(shí),α-烯醇化酶分布于M.bovis的細(xì)胞膜和可溶性胞質(zhì)蛋白組分中,具有抗原性。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Plg預(yù)處理后可以使M.bovis對(duì)EBL細(xì)胞的黏附率提高11.9%,胰蛋白酶對(duì)此株菌進(jìn)行蛋白水解也可以增強(qiáng)M.bovis對(duì)EBL細(xì)胞的黏附,并且比單獨(dú)使用Plg處理細(xì)胞更有效。兔抗α-烯醇化酶血清可以抑制M.bovis對(duì)Plg預(yù)處理后的EBL細(xì)胞的黏附,而未經(jīng)過(guò)Plg預(yù)處理的細(xì)胞黏附則不受影響。配體印跡試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)證明該黏附素結(jié)合蛋白為Plg,呈劑量依賴式,并且這種結(jié)合可以被抗α-烯醇化酶血清所抑制。

2.5 支原體免疫原性脂肪酶A

Sharma等[34]和Lee[35]通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變研究M.bovis基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)milA基因所編碼的支原體免疫原性脂肪酶A(Mycoplasmaimmunogenic lipase A protein,MilA)可能在M.bovis中發(fā)揮重要作用。Adamu等[36]為了進(jìn)一步探索該蛋白的生物功能,利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該蛋白的功能域和生物學(xué)活性進(jìn)行了識(shí)別和預(yù)測(cè),并通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)該蛋白具有黏附素活性,能與HS和1-苯胺萘-8-磺酸各種脂質(zhì)結(jié)合。序列分析表明,MilA黏附素包含經(jīng)典的HS結(jié)合基序“XBBXBX”,并且具有與ATP相互作用的殘基,在其它支原體物種中也存在MilA的同源物。MilA黏附素編碼基因位于M.bovisPG45基因組814 575和822 587之間,包含2 670個(gè)氨基酸,Mr為303 ku,等電點(diǎn)為8.71,具有信號(hào)肽和跨膜區(qū)。該黏附素是一種膜表面蛋白,它的N端(MilA-ab)和C端(MilA-EF)具有免疫原性,而中間部分(MilA-CD)沒(méi)有明顯的免疫反應(yīng)性。MilA在表達(dá)后被水解成226和50 ku的兩個(gè)片段,226 ku片段可被抗MilA-ab和抗MilA-EF血清識(shí)別,而50 ku片段僅被抗MilA-EF血清識(shí)別。MilA黏附素的MilA-EF具有ATP酶活性,而MilA-CD不具有該酶活性。他們還發(fā)現(xiàn)226 ku 的MilA可以在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到,說(shuō)明MilA可能會(huì)分泌到培養(yǎng)基中或翻譯后從細(xì)胞表面裂解。MilA-EF抗血清在體外可抑制M.bovis3683株的增殖,針對(duì)MilA其他區(qū)域的抗血清則不影響該菌株的生長(zhǎng)。HS可與MilA-ab和MilA-EF結(jié)合,但與MilA-CD不結(jié)合,這與MilA的N端和C端存在HS結(jié)合基序的序列分析結(jié)果相符。

2.6 亞甲基四氫葉酸t(yī)RNA-(尿嘧啶-5-)-甲基轉(zhuǎn)移酶

亞甲基四氫葉酸t(yī)RNA-(尿嘧啶-5-)-甲基轉(zhuǎn)移酶[methylenetetrahydrofolate tRNA-(uracil-5-)-methyltransferase,TrmFO]包含427個(gè)氨基酸,Mr為48.8 ku,等電點(diǎn)為6.43,無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū),分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中,具有抗原性[37]。該蛋白的保守性較高,在M.bovis不同菌株間的相似性超過(guò)98%。同時(shí)TrmFO是一種保守的黃素二核苷酸(FAD)結(jié)合蛋白,已被鑒定為tRNA修飾酶的成員負(fù)責(zé)葉酸依賴的m5U-54生物合成[38]。Guo等[37]在開發(fā)M.bovis減毒疫苗時(shí)發(fā)現(xiàn),體外傳代150代的M.bovisHB0801株的TrmFO蛋白表達(dá)水平下調(diào),同時(shí)NOX以及可變脂蛋白VspX這兩種已被鑒定的黏附素表達(dá)也發(fā)生了下調(diào)。在此基礎(chǔ)上,該團(tuán)隊(duì)對(duì)TrmFO的生物學(xué)功能開始進(jìn)一步的驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn),TrmFO可以黏附于EBL細(xì)胞,兔抗TrmFO抗體可顯著降低TrmFO和M.bovis對(duì)該細(xì)胞的黏附,并且該抗體在補(bǔ)體存在下顯示出有效的M.bovis殺傷能力。進(jìn)而證實(shí)了TrmFO是一種M.bovis黏附素,該黏附素的結(jié)合蛋白FN也在該項(xiàng)研究中通過(guò)免疫學(xué)試驗(yàn)證實(shí)。

2.7 可變表面脂蛋白A

辛九慶團(tuán)隊(duì)對(duì)M.bovisHubei-1株進(jìn)行全基因組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的基因vpmaX,該基因被注釋為vspA,但是序列比對(duì)結(jié)果表明該基因編碼蛋白與VspA差異很大,因此將其編碼蛋白命名為可變表面脂蛋白A(variable surface lipoprotein A,VpmaX)[39]。VpmaX是一種由229個(gè)氨基酸組成的大小約為35 ku的膜蛋白。序列分析表明該蛋白具有典型的原核信號(hào)肽和兩個(gè)重復(fù)單元,即“KPSEQGSGTNSQQGSG”和“QGSG”,其中大單元重復(fù)3次,小單元重復(fù)7次,這一結(jié)構(gòu)特征與VSP家族蛋白非常相似。由于M.bovisHubei-1株基因組缺失vsp基因簇,因此他們推測(cè)該蛋白可能是一個(gè)黏附蛋白。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)同樣從湖北省分離的M.bovisHB0801中的VspX的蛋白序列與M.bovisHubei-1菌株的VpmaX的具有100%相似性,這與M.bovis標(biāo)準(zhǔn)株差異較大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),原核生物表達(dá)的rVpmaX蛋白可以直接黏附到EBL細(xì)胞上,抗rVpmaX血清可以阻斷此蛋白的黏附。在鑒定VpmaX的過(guò)程中他們發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象,當(dāng)rVpmaX的濃度較低時(shí),該蛋白主要黏附于EBL細(xì)胞的表面,當(dāng)rVpmaX的濃度較高時(shí),該蛋白可以進(jìn)入EBL的細(xì)胞質(zhì),這表明此蛋白可能與M.bovis入侵細(xì)胞有關(guān)。該團(tuán)隊(duì)在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)所用的M.bovisHubei-1株在含有抗rVpmaX血清的培養(yǎng)基中傳至第5代時(shí)會(huì)表達(dá)一種分子量為55 ku的新蛋白與兔抗rVpmaX血清反應(yīng),這表明該蛋白可能與M.bovisHubei-1株的免疫逃逸有關(guān)。以上研究表明VpmaX是一種M.bovis黏附素,且這種黏附素可能與M.bovis的細(xì)胞入侵和逃逸宿主免疫相關(guān)。

2.8 MBOV_0503編碼蛋白

Zhu等[40]建立了M.bovisHB0801轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù),篩選出9株黏附能力下降的菌株,其中MBOV_0503蛋白突變株特性最穩(wěn)定,該蛋白的突變株對(duì) EBL細(xì)胞的黏附減少了近10倍。經(jīng)分析MBOV_0503黏附蛋白包含548個(gè)氨基酸,Mr為59.48 ku,無(wú)信號(hào)肽,具有跨膜區(qū)。研究證實(shí)MBOV_0503蛋白是一種膜表面蛋白可直接黏附于EBL細(xì)胞表面,與EBL細(xì)胞膜蛋白結(jié)合并且呈劑量依賴性。此外,該蛋白能在一定程度上影響M.bovis與宿主細(xì)胞的黏附。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),MBOV_0503黏附蛋白的缺失導(dǎo)致突變體跨越細(xì)胞屏障的能力顯著下降,但并沒(méi)有影響突變體的增殖。以上研究結(jié)果表明MBOV_0503蛋白是一種M.bovis黏附素,且該黏附素可能與病原菌入侵細(xì)胞能力有關(guān)。

2.9 P27蛋白

郭愛(ài)珍團(tuán)隊(duì)[41]對(duì)M.bovisHB0801株進(jìn)行基因組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)由MBOV_RS03440基因編碼的一個(gè)27 ku的P27蛋白被注釋為一個(gè)假定的脂蛋白,該蛋白包含4個(gè)富亮氨酸的重復(fù)序列(LRRs),有文獻(xiàn)證實(shí)這種重復(fù)序列與細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)輸、酶抑制和激素受體相互作用有關(guān)[42],因此他們推測(cè)該蛋白可能是一種M.bovis黏附素,并通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了這一假設(shè)。P27黏附蛋白包含241個(gè)氨基酸,有信號(hào)肽,無(wú)跨膜區(qū),有抗原性。該蛋白分布于整個(gè)細(xì)胞但大部分暴露在表面,其氨基酸序列高度保守,M.bovis不同菌株間相似性可達(dá)100%,與其他支原體物種的同源蛋白也具有高度的同源性。研究表明重組P27可直接黏附于EBL細(xì)胞上,抗P27血清可特異性阻斷M.bovis黏附。同時(shí)他們還證實(shí)了P27的靶蛋白為FN,并且二者相互作用具有劑量依賴性。

2.10 P26蛋白

Berthold等[43]使用M.bovisJ282菌株的全菌體蛋白作為免疫原制備單克隆抗體,其中一株識(shí)別26 ku蛋白的抗體4F6具有良好的特異性。Sachse等[44]發(fā)現(xiàn)M.bovis對(duì)EBL細(xì)胞的黏附可以被該單克隆抗體4F6特異性的阻斷。P26黏附蛋白是一種親水性的32 ku蛋白,具有抗原性[45]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),M.bovis120菌株中P26蛋白表達(dá)量高于菌株454,在非阻斷條件下120菌株對(duì)EBL細(xì)胞的黏附能力高于454菌株,當(dāng)使用單克隆抗體4F6阻斷時(shí)發(fā)現(xiàn)120和454株M.bovis對(duì)EBL細(xì)胞的黏附分別降低46%和70%,這表明 P26蛋白在M.bovis與EBL細(xì)胞的黏附過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。在他們后期的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)P26蛋白與M.bovis總蛋白的比例為1∶100時(shí),可阻斷20%～50%M.bovis的黏附[45]。這些結(jié)果充分證明了P26蛋白是M.bovis的一種黏附蛋白。

2.11 24 ku蛋白

有報(bào)道稱M.bovis2610 P116(體外傳至第116代)菌株比M.bovis2610 P7(體外傳至第7代)菌株的黏附率下降2.5倍～6倍[46]。Thomas等[46]利用二維電泳對(duì)M.bovis2610 P116菌株和M.bovis2610 P7菌株所表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)Mr為24 ku的蛋白在高傳代菌株中表達(dá)量顯著降低。對(duì)此24 ku蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),該蛋白與M.bovis數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列均不匹配。胰酶消化試驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白是一種膜蛋白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)該蛋白的抗血清或單克隆抗體都可降低2610p7株與BBE細(xì)胞的黏附。以上研究表明該蛋白是一種M.bovis黏附素。

2.12 膜表面可變脂蛋白家族蛋白(VSPs)

在M.bovis標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45基因組中,編碼膜表面可變脂蛋白家族蛋白(membrane surface variable lipoprotein family proteins,VSPs)的基因簇由15個(gè)開放閱讀框組成,其中13個(gè)編碼VSPs[47]。所有VSP蛋白的氨基端都有一個(gè)相似性超過(guò)99%的保守原核信號(hào)肽錨定在細(xì)胞膜上,并且都具有抗原性。Thomas等[48]通過(guò)阻斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)識(shí)別VspC和VspF的單克隆抗體9F1和2A8能夠抑制M.bovis對(duì)BBE細(xì)胞的黏附,單克隆抗體1E5也具有一定的阻斷能力,這表明VspC和VspF可能是一種黏附素。Sachse等[49]在對(duì)M.bovis的VspA、VspB、VspE和VspF的免疫原性和黏附性研究中發(fā)現(xiàn)并鑒定出這些序列都含有重復(fù)序列。用人工合成的重復(fù)序列或針對(duì)這些序列的特異性抗體進(jìn)行M.bovis黏附抑制試驗(yàn),結(jié)果表明VspA、VspB、VspE和VspF以及抗VspA、VspB和VspF的單克隆抗體都可降低M.bovis對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。這表明VspA、VspB、VspC、VspE和VspF是M.bovis的黏附素。但是一些抑制M.bovis與EBL細(xì)胞黏附的單克隆抗體不能抑制M.bovis對(duì)BBE細(xì)胞的黏附[48],這一現(xiàn)象表明M.bovis對(duì)不同宿主細(xì)胞的黏附可能是不同的。

3 M.bovis黏附素結(jié)合蛋白

病原體對(duì)特定組織或細(xì)胞的黏附是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。細(xì)菌黏附素的靶蛋白主要是宿主細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的成分,包括膠原蛋白、彈性蛋白、FN、血小板源性生長(zhǎng)因子和層黏連蛋白等[50]。支原體中位于細(xì)胞膜上的蛋白也可以結(jié)合宿主細(xì)胞的ECM成分進(jìn)而介導(dǎo)支原體的定植或侵襲,如膠原蛋白、層黏連蛋白、FN、Plg和HS[51]。迄今為止,已鑒定出四種類型M.bovis黏附素結(jié)合蛋白,即Plg、FN、HS和APLP2。

3.1 纖溶酶原

纖溶酶原(plasminogen,Plg)存在于血管組織和大多數(shù)體液中,主要合成部位是肝,是一種Mr為92 ku的單鏈血漿糖蛋白,經(jīng)纖溶酶原激活物催化激活后變?yōu)殡p鏈纖溶酶[52]。纖溶酶可以被許多細(xì)菌、真菌、蠕蟲、寄生蟲和病毒利用來(lái)抑制宿主的免疫反應(yīng)和逃避局部免疫攻擊[53]。到目前為止,在共生和致病的細(xì)菌中已經(jīng)報(bào)道了超過(guò)40種病原微生物以Plg為結(jié)合蛋白[53],從而促進(jìn)其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲,如化膿性鏈球菌與人Plg結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)鏈激酶切割并提高菌體毒力[54],多殺性巴氏桿菌能夠利用宿主Plg來(lái)跨越組織屏障和逃避宿主先天免疫[55],結(jié)核分枝桿菌與Plg結(jié)合后促進(jìn)其組織重建和對(duì)宿主的侵襲[56]。在支原體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵支原體、Leachii支原體、M.bovis、雞毒支原體、雞滑液支原體、豬肺炎支原體、肺炎支原體、豬鼻支原體和無(wú)乳支原體能夠與Plg結(jié)合[57-59]。這也提示我們Plg在可能在M.bovis定植過(guò)程中起著重要作用,并與M.bovis的發(fā)病機(jī)制和免疫逃逸密切相關(guān),其結(jié)合和激活可能是M.bovis毒力決定因素之一。

3.2 纖連蛋白

纖連蛋白(fibronectin,FN)是一種高分子量的多功能細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,廣泛存在于血液、體液及各種組織中。FN主要有兩種形式:血漿纖維連接蛋白和細(xì)胞纖維連接蛋白,其主要功能是將細(xì)胞與細(xì)胞的ECM連接起來(lái)[60]。纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(FnBPs)是多種病原體重要的黏附素,已有研究證實(shí)支原體中存在FnBPs,如M.bovis的NOX[22]、FBA[30]、MbfN[32]、TrmFo[37]和P27[41]、豬肺炎支原體的NADH氧化酶[61]、雞滑液支原體的二氫脂酰胺脫氫酶[62]、無(wú)乳支原體的MAG_6130黏附素[59]以及豬鼻支原體的烯醇化酶[63]。FnBPs不僅存在于支原體中,許多細(xì)菌真菌以及病毒都可與FN結(jié)合,目前已經(jīng)鑒定出100多種細(xì)菌FnBPs[64]。FnBPs在細(xì)菌與其宿主的相互作用中起著關(guān)鍵作用,許多研究表明一些FN結(jié)合蛋白基因的失活會(huì)顯著降低細(xì)胞的黏附性,如金黃色葡萄球菌的fnbA和fnbB雙突變體[65]、化膿性鏈球菌的prtFI突變體[66]。有證據(jù)表明,FN也會(huì)參與病原體的入侵以及具有信號(hào)傳遞作用,如金黃色葡萄球菌黏附蛋白與FN結(jié)合后招募整合素通過(guò)內(nèi)吞途徑入侵靶細(xì)胞[67]、豬肺炎支原體通過(guò)和FN相互作用后與上皮細(xì)胞表面的整合素β1結(jié)合,并啟動(dòng)信號(hào)事件刺激病原體進(jìn)入網(wǎng)格蛋白包被的囊泡和小窩體中[68]。由于牛支原體也利用該蛋白作為黏附素結(jié)合蛋白,所以應(yīng)對(duì)牛支原體是否利用該蛋白進(jìn)行細(xì)胞入侵進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3 硫酸肝素

硫酸肝素(heparan sulfate,HS)為一種硫酸糖胺聚糖,廣泛分布于大多數(shù)動(dòng)物組織的細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)[69]。HS在高爾基體中合成,由重復(fù)的N-乙酰氨基葡萄糖和己糖醛酸殘基組成[70]。其強(qiáng)大的陰離子特性和高度可變的結(jié)構(gòu)使這種糖胺聚糖能夠?yàn)樵S多蛋白質(zhì)配體(包括免疫系統(tǒng)的許多可溶性介質(zhì))提供結(jié)合位點(diǎn),并可能促進(jìn)或抑制其活性[69]。已證實(shí)HS蛋白聚糖是多種病原體黏附和定植的靶蛋白,參與病原體的內(nèi)化過(guò)程,促進(jìn)黏附、附著和進(jìn)入細(xì)胞,與逃避免疫防御和致病機(jī)制密切相關(guān)[71],如豬肺炎支原體裂解產(chǎn)物P159結(jié)合于HS促進(jìn)其定植PK15細(xì)胞,并且可能與病原體內(nèi)化有關(guān)[72]、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌與HS結(jié)合以促進(jìn)其附著和內(nèi)化,進(jìn)而穿過(guò)腸道黏膜進(jìn)入體循環(huán)引起菌血癥和腦膜炎[73]、細(xì)胞表面 HS 的失活有效的減少了白色念珠菌和光滑念珠菌對(duì)該細(xì)胞的黏附[74]。在M.bovis中與HS結(jié)合的MbfN[32]和MilA[36]以及有待鑒定的M.bovis黏附素是否也參與了病原菌的內(nèi)化幫助其入侵還有待學(xué)者們進(jìn)一步的探索。

3.4 淀粉樣前體樣蛋白2

淀粉樣前體樣蛋白2(amyloid precursor-like protein-2,APLP2)是淀粉樣前體蛋白(APP)的第一個(gè)同源物。APP在哺乳動(dòng)物中具有兩種同源物:淀粉樣前體樣蛋白1(APLP1)和APLP2,三者在進(jìn)化上高度保守,這三種蛋白每個(gè)蛋白都由一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)50個(gè)氨基酸長(zhǎng)的胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域組成[75]。APLP2對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體生存、運(yùn)動(dòng)功能、突觸發(fā)育、髓鞘形成、視網(wǎng)膜發(fā)育、葡萄糖和胰島素穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞黏附、癌癥生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞周期退出和金屬穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[76]。對(duì)基因敲除小鼠的研究已經(jīng)證實(shí),與APP和APLP1相比,APLP2是APP家族中小鼠存活所需的必要成員[77-78]。APP和APLP-2在基因上相關(guān),但在轉(zhuǎn)錄上不同,在每個(gè)基因中都有獨(dú)特的序列基序,具有特殊的、不重疊的功能[75]。雖然APLP-2是細(xì)胞黏附的重要組成部分,但是APLP-2作為病原體受體的報(bào)道較少,目前已證實(shí)APLP-2是M.bovis黏附的靶蛋白[22],對(duì)于其在M.bovis致病機(jī)制中所扮演角色的相關(guān)研究還存在空缺。

4 小結(jié)與展望

本文對(duì)M.bovis目前已鑒定黏附素的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、部分生物學(xué)特性以及宿主結(jié)合蛋白進(jìn)行了綜述。其中將生物信息學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)生物學(xué)及免疫學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合,或者利用不同菌株間的表型和基因型進(jìn)行差異基因篩選均為M.bovis黏附素篩選可行方案。研究表明M.bovis黏附素在感染、病原體定植入侵和宿主損傷中具有關(guān)鍵作用。目前已鑒定的M.bovis黏附素大部分為膜表面蛋白,部分黏附素具有良好的保守性和免疫原性,并且具備多種生物活性,它們的主要宿主結(jié)合蛋白為HS、Plg、FN和APLP2,其中HS、Plg和FN可與多種已鑒定的M.bovis黏附素結(jié)合。有些M.bovis黏附素結(jié)合蛋白可能與多種病原感染密切相關(guān),如Plg是多種細(xì)菌黏附素的靶蛋白,說(shuō)明這些病原的定植與入侵可能具有相同或相似的機(jī)制。此外,鑒于M.bovis可以感染多種動(dòng)物,可引起多種組織器官感染并導(dǎo)致多種臨床癥狀,而當(dāng)前鑒定的黏附素主要針對(duì)EBL細(xì)胞和MDBK細(xì)胞,且這兩種細(xì)胞的黏附素也存在差異,因此不難推測(cè)尚有針對(duì)不同細(xì)胞的重要黏附素還有待驗(yàn)證。

M.bovis已經(jīng)成為危害養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的重要病原之一,對(duì)牛場(chǎng)及養(yǎng)殖戶收益影響較大,因此對(duì)M.bovis疾病的預(yù)防和控制是養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)興旺發(fā)展的關(guān)鍵舉措。M.bovis無(wú)細(xì)胞壁特性使其致病性高度依賴于細(xì)胞表面的黏附素。黏附素是M.bovis研究的一個(gè)重要方向,加強(qiáng)M.bovis黏附素的研究將有助于M.bovis致病機(jī)制的闡明,同時(shí)對(duì)預(yù)防性和診斷性生物制品的研發(fā)以及小分子靶向抗菌藥物的開發(fā)均具有重要的理論指導(dǎo)意義。