miR-150靶向AOC3調控綿羊前體脂肪細胞分化的研究

張寒月,趙 丹,梁 煜,趙弼時,范蒙丹,喬利英,劉建華,楊凱捷,潘洋洋,劉文忠

(山西農業大學動物科學學院,太谷 030801)

脂肪沉積的過程十分復雜,而廣靈大尾羊尾部脂肪的含量在動物體脂肪沉積中占較大比例,脂肪沉積量的提高在綿羊養殖中具有重要意義[1-3]。羊尾脂作為動物皮下脂肪組織的一類,是在惡劣生存環境下通過自然選擇遺傳進化而來的,不僅能為胴體提供日常營養[4],還能為對抗缺水少糧的惡劣環境提供能量[5]。此外,羊尾脂在工業方面、醫藥方面、飲食方面都發揮著重要的作用[6]。機體多余的能量以甘油三酯為最主要的存在形式存儲于綿羊尾部的白色脂肪組織中[7],在能量平衡中起著不可或缺的作用,為機體提供所需的大量熱能[8]。脂肪細胞作為脂肪組織的主要成員之一,受調控因子的影響進而決定脂肪組織的沉積量。許多研究表明,microRNAs(miRNAs)等調控因子直接或間接參與脂肪組織發育以及能量代謝[9]。研究脂肪細胞的細胞發育和能量代謝中發揮重要作用的調控因子及其作用機制具有重要意義。

miRNAs是小的內源性RNA,由大約22個核苷酸組成,miRNAs(從核苷酸2到8)與靶標mRNA的3′非翻譯區域(UTR)互補性介導,從而抑制mRNA翻譯[10]。miRNAs在不同的物種有較高的保守性,這表明它們在生物體生理學中具有重要作用,參與關鍵的細胞過程和疾病[11-13]。在miRNAs中,miR-150被稱為循環miRNA,參與脂蛋白運輸的過程[14-16]。bta-miR-150通過靶向mTOR信號通路中的AKT1,抑制牛前體脂肪細胞的分化[17]。miR-150可以通過調節小鼠B細胞與其他免疫細胞的相互作用來調節肥胖相關的胰島素抵抗和組織炎癥[14]。miR-150對B細胞發育至關重要,并通過調節脂肪組織B細胞功能抑制肥胖相關的炎癥[18]。綜上,miR-150影響著各物種機體的脂質代謝,但miR-150對廣靈大尾羊的尾部脂肪發育過程的影響尚不清楚。

含銅胺氧化酶3(amine oxidase copper contatining 3,AOC3),又稱為血管凋亡誘導蛋白1(vascular apoptosis-inducing protein 1,VAP1)。AOC3在哺乳動物組織中的分布范圍很廣,在脂肪細胞和脂肪組織中表現出相對較高的表達[19]。AOC3與白細胞外滲到發炎組織中有關,被作為粘附蛋白。但在脂肪細胞中AOC3被認為不作為粘附蛋白起作用,其作用可能是參與胰島素信號傳導和脂肪酸代謝的調節[20]。小鼠敲除AOC3,可減少白細胞浸潤到脂肪組織中,有利于小鼠脂肪沉積[21]。在豬中,AOC3是DNA甲基化的候選基因之一,且通過DNA甲基化來調控脂肪的沉積,進而影響肥胖癥[22]。綜上,AOC3在脂肪代謝中有著重要的作用,但AOC3在脂肪細胞發育過程中的作用機制尚不明確。

本研究基于本課題組前期的測序結果及幼齡動物的組織細胞比老齡動物的組織細胞更易于培養的經驗,在5日齡的廣靈大尾羊中采集試驗材料。旨在研究miR-150通過靶向AOC3的3′-UTR調控綿羊前體脂肪的分化,調控脂肪的沉積作用,更為清晰的闡述miRNA通過靶向下游靶基因的3′-UTR調控綿羊脂質代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品的采集 在實驗室內采集5日齡廣靈大尾羊的尾部脂肪,采樣步驟如下:屠宰后,立刻用剃毛器除去廣靈大尾羊的尾部毛發,露出尾部皮膚,防止毛發污染脂肪組織。用手術刀在尾部皮膚上開出創口,使得尾部脂肪暴露于表面。用無菌的手術剪與手術鑷將脂肪組織與動物體分離,分離時盡量避開尾部的血管。分離后,先在75%的酒精中清洗脂肪組織,之后轉移至含有1%雙抗(青霉素與鏈霉素)的預冷PBS(phosphate buffered solution)中,冰上保存,立刻帶入細胞房中,在超凈臺中進行組織分離與細胞培養。

1.1.2 儀器與試劑 Ⅱ型膠原酶、牛胰島素、羅格列酮、地塞米松、IBMX和油紅O染色試劑購自索萊寶生物有限公司;TB Green?Premix Ex TaqTMII、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和Trizol試劑購自TaKaRa公司;細胞培養級PBS、高糖培養基、胰蛋白酶和雙抗購自Gibco公司;胎牛血清購自Dcell公司;蛋白裂解試劑盒與蛋白凝膠制備試劑盒購自BOSTER公司;AOC3抗體購自Proteintech公司;β-actin抗體購自Immunoway公司;膠回收與質粒提取試劑盒購自Omega公司;轉染試劑Lip3000購自Invitrogen公司;Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪組織的分離與細胞培養 將待分離的脂肪組織放入少量含1%雙抗的PBS的6 cm培養皿中,用組織分離剪與鑷子(無菌)將組織上微量血管剔除,并將其剪碎至肉糜狀,收集至無菌的15 mL離心管中,向離心管中加入與組織液等量的Ⅱ型膠原酶在孵育搖床上消化(30 min、37 ℃、300 r·min-1),加入完全培養基(含1%雙抗和10%胎牛血清)終止消化后,分別用70和40 μm的細胞篩過濾,鋪至10 cm的培養皿中,得到前體脂肪細胞。

在培養箱(37 ℃,5% CO2)中培養細胞,每隔2 d更換一次完全培養基。待細胞長滿后,更換為誘導分化培養基(0.5 mmol·L-1IBMX、1.0 μmol·L-1地塞米松和1.0 μmol·L-1牛胰島素),誘導分化3 d后,更換為維持培養基(1.0 μmol·L-1牛胰島素),待細胞分化10 d后,對細胞進行油紅O染色處理,顯微鏡下觀察脂滴的生成量。采用細胞免疫熒光法檢測脂肪細胞因子Adiponectin的含量以鑒定細胞的純度[23]。

1.2.2 qPCR檢測 本試驗采用Trizol-氯仿-異丙醇法提取組織和細胞的總RNA,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑對提取的總RNA進行反轉錄得到所需cDNA后,并使用TB Green?Premix Ex TaqTMII試劑對目的基因進行qPCR檢測試驗,qPCR引物如表1所示。

表1 qPCR引物序列

1.2.3 miR-150過表達與干擾載體的構建 根據miRbase數據庫查詢出oar-mir-150的成熟序列,由上海生物工程股份有限公司合成miR-150的mimics、mimics NC、inhibitors和inhibitors NC,序列如表2所示。

表2 miR-150的序列信息

1.2.4 miR-150的靶基因預測 依據本課題組對廣靈大尾羊尾部脂肪的高通量測序數據分析結果,miR-150靶向AOC3、IBTK、KHNYN和VAMP2等多個基因,使用BiBiServ2、miRBas等多個軟件對miR-150與AOC3進行結合位點的預測,發現二者存在結合位點,說明miR-150與AOC3可能存在靶標關系。

依據NCBI數據庫中綿羊AOC3(登錄號:XM_015098797.3)的序列,設計AOC3的3′-UTR野生型與突變型擴增引物序列,引物序列見表3。

表3 AOC3的3′-UTR序列信息

1.2.5 綿羊AOC3過表達和干擾載體的構建 根據NCBI中AOC3的數據,設計2對AOC3 CDS區序列的干擾序列(AOC3-sh1、AOC3-sh2)和1對干擾對照序列(AOC3-shNC),序列如表4所示。

表4 AOC3的表達引物序列信息

2 結 果

2.1 綿羊前體脂肪細胞的培養與成脂能力的鑒定

體外培養綿羊尾部前體脂肪細胞4 d后,細胞形態呈梭形(圖1A)。誘導分化10 d后,細胞形態發生改變生成大量脂滴,采用油紅O染色的方法對其鑒定,脂肪細胞分化的脂滴呈紅色(圖1B)。采用免疫熒光染色檢測Adipogenictin的表達發現,紅色熒光分布于細胞質中(圖1C),藍色熒光表示細胞核(圖1D),95%以上的細胞帶有紅色熒光(圖1E),表明試驗中體外培養的綿羊尾部脂肪細胞為綿羊前體脂肪細胞,純度達到95%以上,可用于后續試驗。

A.綿羊前體脂肪細胞;B.成脂誘導的綿羊前體脂肪細胞;C～E.Adiponectin標記的綿羊前體脂肪細胞純度鑒定

2.2 miR-150在不同脂肪組織的qPCR結果

在前期課題組測序結果中可篩選出miR-150,且3個不同部位脂肪組織定量結果顯示,所篩選出的miR-150在各組織中均有表達,miR-150在尾部脂肪表達量高,差異極顯著(P<0.001,圖2)。因此選擇miR-150為后續試驗對象,在綿羊尾部脂肪中進行功能驗證。

***表示P<0.001;n.s.表示P>0.05,下同

2.3 miR-150對綿羊前體脂肪細胞分化作用的影響

培養綿羊尾部前體脂肪細胞,待匯集度達到80%后,通過轉染miR-150 mimics與miR-150 inhibitors來實現對miR-150的過表達與抑制。48 h后檢測轉染效率顯示,與其陰性對照組相比過表達miR-150組的表達極顯著上調(P<0.001),抑制miR-150則結果相反(圖3A),說明成功實現了對miR-150的過表達與抑制。

A.過表達和干擾miR-150后miR-150的相對表達;B.過表達和干擾miR-150后AOC3的相對表達;C.過表達miR-150后成脂標志基因的相對表達;D.干擾miR-150后成脂標志基因的相對表達;E.AOC3蛋白的表達;F.AOC3蛋白相對表達量。* P<0.05,** P<0.01,下同

待前體脂肪細胞匯集度達到100%時,用誘導分化培養基對細胞進行4 d的誘導培養,維持培養基進行6 d的培養。檢測得到,過表達miR-150后,下游靶基因AOC3和脂肪分化標志基因C/EBPα的mRNA表達量極顯著下降(P<0.01),其他脂肪分化標志基因Adiponectin、PPARγ和FABP4的mRNA表達量顯著下降(P<0.05,圖3B、3C)。抑制miR-150后,則結果相反(圖3B、3D)。Western blotting檢測得到,過表達miR-150組與NC組相比較,AOC3蛋白的相對表達量極顯著下調(P<0.01),抑制miR-150組與NC組相比較,結果相反(圖3E、3F)。油紅O染色可知,過表達miR-150的細胞較其對照組產生較少脂滴;而抑制miR-150則脂滴較多,表明miR-150抑制脂滴沉積(圖4)。綜上,miR-150下調AOC3和成脂分化標志基因的表達,抑制綿羊前體脂肪細胞的成脂分化。

2.4 miR-150 和AOC3的靶標關系

由BiBiServ2預測軟件可知miR-150的種子區序列與下游基因AOC3的3′-UTR存在結合位點,如圖5A所示。圖5B所示為miR-150與AOC3的3′-UTR的種子區結合位點。分別構建AOC3的3′-UTR的野生型與突變型載體,并同miR-150 mimics與mimics NC進行共轉染。由圖5C可知,miR-150 mimics極顯著降低了AOC3的3′-UTR野生型的熒光活性(P<0.001),而AOC3的3′-UTR的突變型組與其陰性對照的熒光活性差異不顯著(P>0.05)。結果可知,AOC3是miR-150的下游靶基因。

A,B.RNAhybird預測miR-150和AOC3的結合位點;C.AOC3 3′-UTR重組雙熒光質粒的相對熒光活性

2.5 過表達和干擾AOC3對綿羊前體脂肪細胞分化的影響

構建AOC3的慢病毒過表達和干擾載體,通過共轉染工具細胞293 T,對綿羊前體脂肪細胞進行慢病毒介導來實現AOC3的過表達與干擾。在293 T細胞和綿羊前體脂肪細胞中都出現了大量綠色熒光。分別如圖6A、6B所示。表明AOC3慢病毒包裝效果良好,并成功感染了綿羊前體脂肪細胞。

A.在293T細胞中包裝慢病毒;B.慢病毒感染綿羊前體脂肪細胞。pHB-AOC3.過表達AOC3;pHB-NC.對照;AOC3-sh1.干擾AOC3-1;AOC3-sh2.干擾AOC3-2;AOC3-shNC.shRNA對照;下同

待細胞匯集到90%以上,對細胞進行誘導分化處理。檢測得到,過表達組與其陰性對照組相比,AOC3的表達極顯著上調(P<0.01),AOC3-sh1、AOC3-sh2與其陰性對照組相比,AOC3-sh1顯著下調了AOC3的表達(P<0.05),AOC3-sh2極顯著下調了AOC3的表達(P<0.01),說明成功實現了對AOC3的過表達與干擾,并且AOC3-sh2的干擾效果更好(圖7A、7C)。所以選擇AOC3-sh2作為后續試驗對象。過表達AOC3后,成脂分化標志基因PPARγ(P<0.001)、Adiponectin、C/EBPα和FABP4的mRNA表達量均極顯著上調(P<0.01),如圖7B所示。干擾AOC3后,結果與其相反(圖7D)。過表達AOC3組與NC組相比較,AOC3蛋白的相對表達量極顯著上調(P<0.001),干擾AOC3組與NC組相比較,結果相反(圖7E、7F)。說明在蛋白水平也成功實現了對AOC3的過表達和干擾。AOC3能夠上調成脂分化標志基因的表達,進而促進綿羊前體脂肪的成脂分化。

A.過表達AOC3后AOC3的相對表達;B.過表達AOC3后成脂標志基因的相對表達;C.干擾AOC3后AOC3的相對表達;D.干擾AOC3后成脂標志基因的相對表達;E.AOC3蛋白的表達;F.AOC3蛋白相對表達量

油紅O結果顯示,過表達AOC3組產生較多脂滴,干擾AOC3組產生的脂滴較少(圖8)。表明過表達AOC3后,促進了綿羊前體脂肪細胞的脂滴形成。綜上所述,可知AOC3可促進綿羊前體脂肪細胞的成脂分化。

圖8 過表達和干擾AOC3后綿羊前體脂肪細胞油紅O染色結果圖

3 討 論

miRNA與相應的靶基因相互作用,抑制mRNA的表達,并阻斷翻譯過程或啟動切割。miRNA和mRNA之間復雜的相互作用有助于更好地了解潛在的生物過程[24]。最初研究發現,miRNAs可多結合于靶基因的3′-UTR,例如miR-15a、miR-15b和miR-16通過靶向MYCN的3′-UTR抑制其表達[25]。經研究發現,miR-346通過靶向APP的5′-UTR區上調其表達和淀粉樣蛋白β產生[26];miR-532-5p mimics通過與人HT-29 CRC細胞中RUNX3的5′-UTR特異性結合,顯著下調了RUNX3的表達量和蛋白質水平[27]。關于結合位點處于CDS區的位置研究表明,miR-646通過靶向MIIP的CDS區破壞了其mRNA的穩定性,抑制了MIIP的表達,進而抑制了胰腺癌細胞在體內外的增殖和侵襲能力[28]。由此可知,miRNAs與靶基因的結合位點存在多樣性。本研究通過雙熒光素酶活性報告驗證得到miR-150與AOC3的3′-UTR存在結合位點。且miR-150與AOC3的表達呈負相關性。由以上可知,miRNAs與下游靶基因的結合位置存在差異性,miRNAs靶向基因的5′-UTR時正調控基因的表達;靶向基因的3′-UTR和CDS區時負調控基因的表達。因此,對基因的調控作用是否受二者結合位點所在位置影響,可以做更進一步的探究。

miRNAs通過調控靶基因的表達既能促進脂肪細胞的分化,又能抑制脂肪細胞的分化。研究表明,gga-miR-106-5p通過結合KLF15,抑制雞的腹部脂肪生成[29]。MYOD1通過結合miR-206來抑制KLF4表達進而抑制脂肪細胞分化[30]。miRNAs與目的基因結合抑制了脂肪的分化。也有文獻提出,miR-34a通過靶向AdipoR2抑制AMPK信號通路進而抑制PPARα的信號傳導,使脂滴生成量增加[31]。miR-370-3p、miR-345-5p分別通過結合MKNK1和VEGF-B的3′-UTR,調控脂肪生成和脂肪酸代謝[32-33]。本研究表明,在綿羊前體脂肪細胞中,miR-150有效地降低了成脂分化標志基因的表達,從而減少了脂滴的沉積量。可知,miRNAs對脂肪分化有著重要的影響,因此,研究miRNA對廣靈大尾羊尾部前體脂肪細胞分化的影響可提高綿羊養殖場的經濟效益。

miR-150是調節脂肪細胞炎癥的小RNA之一[34],可在生理上調節細胞和動物的脂質代謝和炎癥反應[35]。一項有關于巨噬細胞的研究顯示,miR-150可調控脂質積累并且與細胞的促炎因子表達升高有關[36]。敲除miR-150的小鼠高脂飲食后,全身重量減輕,脂肪堆積減少,表現出肥胖相關組織炎癥和全身胰島素抵抗加劇[14]。以上多項研究表明,miR-150是影響脂質代謝和炎癥發生的研究熱點。而在家畜模型中的研究發現,在豬脂肪組織中,miR-150-5p通過調控CYP3A4促進游離脂肪酸誘導脂肪變性[37]。miR-150能夠促進肉牛前體脂肪細胞的增殖,在肉牛前體脂肪細胞分化的階段,miR-150又可以通過靶向AKT1抑制肉牛前體脂肪細胞分化[17]。近幾年有關于miR-150的研究從小鼠動物模型轉向了家畜。因此,本研究以綿羊前體脂肪細胞為模型,在廣靈大尾羊尾部前體脂肪細胞中轉染miR-150 mimics后,脂肪分化標志基因C/EBPα(P<0.01)、Adiponectin(P<0.05)、PPARγ(P<0.05)和FABP4(P<0.05)的表達量均下調,脂滴的形成減少;干擾miR-150后,得到相反結果。由以上結果可知,miR-150通過抑制成脂分化基因的表達,進而抑制綿羊前體脂肪細胞分化,同時也抑制了下游靶基因AOC3的表達。然而,miR-150對綿羊前體脂肪細胞的調控是直接作用于脂肪標志基因,還是通過其他調控因子間接作用于脂肪標志基因有待研究。因此,本試驗還對miR-150的下游靶標基因AOC3進行了研究。

慢病毒載體是遞送遺傳物質最常用的轉移載體之一,是分子轉染試驗的首選載體[38]。慢病毒生產系統是基于瞬時生產的,通過快速有效地共轉染293 T細胞。轉染48～72 h后收獲病毒上清液,滴度達到106～108UT·mL-1[39]。本試驗在對AOC3功能驗證中采用了慢病毒載體轉染293 T細胞,在慢病毒包裝質粒和293 T的輔助下,成功包裝為具有感染性的病毒顆粒,收集病毒液后感染綿羊前體脂肪細胞,在綠色熒光以及AOC3的表達量定量數據的鑒定下,成功實現了對目的基因AOC3在綿羊前體脂肪細胞中的過表達和抑制。采用慢病毒包裝質粒對目的基因進行功能驗證,該試驗過程需小心謹慎和防止感染液的污染,但該試驗方法可以更直觀的觀察試驗現象,并及時發現試驗是否有必要繼續進行。

AOC3通過編碼胺氧化酶調控脂肪組織中的組胺氧化促進脂肪細胞的分化[40],因此AOC3在脂質形成中發揮著重要作用。本研究過表達AOC3后,成脂分化標志基因的表達量均極顯著上調(P<0.01),脂滴的形成增多。因此,AOC3能夠通過調控脂肪分化標志基因的表達進而促進綿羊前體脂肪細胞的分化。研究表明,AOC3是DNA甲基化的候選基因之一,且通過DNA甲基化來調控脂肪的沉積,進而影響肥胖癥[22,41]。以上文獻說明,AOC3與脂質代謝密切相關。本試驗在廣靈大尾羊的前體脂肪細胞中對AOC3進行分子水平的驗證,可為分子遺傳提供一定的理論基礎。

4 結 論

通過軟件預測與試驗驗證,miR-150與AOC3的3′-UTR存在結合位點。在脂肪細胞分化的過程中,miR-150與AOC3的表達量呈負相關性,miR-150作為綿羊前體脂肪細胞分化的抑制劑,通過靶向下游靶基因AOC3的3′-UTR抑制脂肪分化,減少脂滴生成,從而影響綿羊脂肪細胞的分化,為綿羊尾脂在工業、醫藥和飲食方面的重要作用提供更好的科學理論依據。