亮氨酸對黃牛皮下脂肪細胞棕色化的影響

郭逸芯,王之盛*,胡 瑞,王俊梅,王 森,施麗媛,張曉紅,鄒華圍,左家學,彭全輝,薛 白,王立志

(1.四川農業大學動物營養研究所,肉用牛低碳養殖創新團隊,四川省牛低碳養殖與安全生產高校重點實驗室,成都 611130;2.臨滄市畜牧技術推廣站,臨滄 677099)

脂肪是動物體內最大的能量貯存庫,在維持體溫恒定和機體能量代謝過程中起重要作用。棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)可通過非顫抖性產熱的方式維持動物體溫,幫助幼畜抵御寒冷,提高其存活率[1]。動物的生長和組織的發育需要大量能量,該過程伴隨著脂肪組織的沉積。然而,皮下脂肪的食用價值較低,其過度沉積不僅影響胴體品質,還增加飼料消耗和生產成本,進而制約生產效益[2]。BAT使得脂肪酸和葡萄糖分解產生的化學能轉化為熱能,進而促進脂肪消耗,定向調節動物脂肪沉積,改善肉品質[3]。此外,相較于白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT),BAT含有更多不飽和脂肪酸,更有利于消費者健康[4-5]。然而隨著哺乳動物的生長發育,BAT逐漸減少,僅占成年后機體脂肪組織的10%。因此,探究家畜BAT的調控手段,對探究脂肪的營養代謝調控和肉牛的機體養分沉積有重要的意義。

WAT和BAT中的脂肪細胞在形態和功能上存在一定差異。白色脂肪細胞(white adipocyte,WA)含有唯一的大單房脂滴,線粒體數量少,其功能主要是以甘油三酯的形式儲存能量,多分布于皮下和內臟周圍。棕色脂肪細胞(brown adipocyte,BA)含有多房小脂滴,富含線粒體與解偶聯蛋白(UCP1)。此外,WAT內還存在著 “米色脂肪細胞(beige adipocyte)”,其脂滴大小和線粒體數量介于WA與BA之間,高表達UCP1,功能與BA相似。在一定條件下,米色脂肪細胞能由WA受到誘導和激活而產生,該過程被稱為“白色脂肪細胞棕色化”。米色脂肪細胞雖也表達UCP1,但它還獨特表達Cited1、CD137和TMEM26等基因[6-7]。目前,白色脂肪棕色化的研究多集中于人類與小鼠,該現象為人類開辟了通過靶向脂肪組織調控肥胖以及一系列疾病的可能性[8]。

作為功能性氨基酸,亮氨酸在調節代謝和生理過程中發揮多種作用。它具有調節蛋白質合成、傳導胰島素信號、促進葡萄糖攝取和改善動物免疫力的功能[9]。研究表明,亮氨酸能促進脂肪細胞向肌肉細胞的能量分配,減少脂肪細胞中脂質儲存,促進肌肉細胞對脂質的利用[10]。此外,亮氨酸也被證實能夠影響線粒體含量,促進線粒體生物合成,從而增強細胞呼吸和能量分配[11]。動物營養領域中,亮氨酸在促進畜禽肌肉蛋白質合成方面研究較為廣泛,對脂肪沉積方面的研究較少。研究證明,肥胖小鼠飼料中額外添加亮氨酸能促進其白色脂肪棕色化[12,9],但亮氨酸對反芻動物白色脂肪棕色化的影響機制尚不清楚。

本研究以黃牛皮下脂肪細胞為試驗材料,重點研究亮氨酸調控白色脂肪細胞棕色化以及對脂肪細胞脂質代謝的影響。旨在從細胞水平探究亮氨酸對黃牛皮下脂肪細胞棕色化和脂質積累的調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MEMα培養基、DMEM高糖培養基、無菌 PBS、胎牛血清(FBS)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;L-亮氨酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、羅格列酮(RSG)購自美國Sigma公司;青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(三抗)、地塞米松(DEX)、牛胰島素(INS)、I型膠原酶、BCA蛋白分析試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;油紅O粉末購自北京博奧森生物技術有限公司;總RNA提取試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;RNA反轉錄試劑盒、RT-PCR擴增預混合溶液購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;一抗稀釋液、RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、超極敏ECL發光試劑盒、Mito-Tracker Green(線粒體綠色熒光探針)購自上海碧云天生物技術有限公司;β-actin、UCP1、CD137、SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、PGC1α一抗和鼠抗兔IgG購自江蘇親科生物研究中心有限公司;細胞基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;ATP含量檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 試劑配置

生長培養基組成為MEMα培養基、10% FBS、1%三抗。誘導培養基為DMEM高糖培養基、10% FBS、1%三抗,添加10 μg·mL-1INS、0.25 μmol·L-1Dex、0.5 mmol·L-1IBMX和1 μmol·L-1RSG。維持培養基為DMEM高糖培養基、10% FBS、1%三抗,添加10 μg·mL-1INS和1 μmol·L-1RSG。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃牛前體脂肪細胞的分離培養 于屠宰場采取4頭3歲育肥的健康雄性黃牛((351.7±42.5) kg)皮下脂肪組織,參照郭紅芳等[13]和王森等[14]前體脂肪細胞分離培養方法分離黃牛前體脂肪細胞。分離出的細胞用生長培養基重懸后接種于培養瓶中,差速貼壁1 h純化細胞,隨后在37 ℃、CO2濃度為5%的培養箱中培養,每2 d更換1次培養基,直至傳代和凍存備用。

1.3.2 黃牛前體脂肪細胞的誘導分化和試驗處理 黃牛前體脂肪細胞誘導分化及試驗處理方案如圖1所示。將不同來源的前體脂肪細胞混合并接種于6孔板中,細胞生長至90%后,接觸抑制2 d再進行誘導分化。使用分化誘導培養基培養細胞3 d后,再更換為額外添加不同濃度亮氨酸(0、0.5、1、2、4、8 mmol·L-1)的分化維持培養基處理3 d。篩選誘導脂肪細胞棕色化的亮氨酸濃度,后續試驗分為對照組(CON)和亮氨酸添加組(Leu)。每個處理組6個重復。

圖1 黃牛前體脂肪細胞誘導分化及試驗處理方案[15]

1.3.3 油紅O染色和異丙醇萃取 適量PBS洗滌細胞3次,10%福爾馬林溶液固定細胞35 min。PBS洗滌3次后加入油紅O工作液染色50 min。之后吸去油紅O工作液,PBS洗滌細胞3次,再用60%異丙醇洗掉浮色。干燥后用倒置顯微鏡觀察并拍照。然后用異丙醇萃取油紅O染料,加入96孔板,在490 nm波長下讀取OD值。

1.3.4 細胞活力檢測 將黃牛前體脂肪細胞接種于96孔板中,細胞密度為1×105個·mL-1,分化后期更換添加不同濃度亮氨酸(0、0.5、1、2、4、8 mmol·L-1)的分化維持培養基。孵育24 h后,每100 μL培養液中加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h,在450 nm波長下讀取OD值。

1.3.5 細胞總RNA的提取與RT-PCR 提取細胞總RNA并檢測濃度后,按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR,反應體系為:SYBR Green Master Mix 5 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、cDNA 1 μL、RNase Free H2O 3.6 μL。反應程序為:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,40個循環;65 ℃延伸5 s,95 ℃再延伸5 min。GAPDH作為內參,用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。RT-PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司設計合成,序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.3.6 免疫印跡雜交 PBS洗滌細胞后,用RIPA蛋白裂解液(1 mmol·L-1PMSF)提取細胞總蛋白,然后對裂解細胞進行超聲波破碎(該步驟在冰水混合物上進行),并在4 ℃以13 000 r·min-1離心15 min。離心后,采用BCA蛋白分析試劑盒測定上清液蛋白濃度,加入5×上樣緩沖液后99 ℃金屬浴變性10 min。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質,80 V電壓電泳30 min,然后120 V電泳至溴酚藍指示劑到達分離膠底部,100 V恒壓80 min轉移蛋白印跡至PVDF膜上。轉印完的PVDF膜用5%脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h,加入一抗(抗體的稀釋比見表2),4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后,與二抗(鼠抗兔IgG 1∶5 000稀釋)室溫搖床孵育1 h,ECL試劑顯色。以β-actin為內參。

表2 Western Blot中使用的抗體

1.3.7 Mito-Tracker Green染色 去除6孔板中細胞培養液,加入配制好37 ℃預溫育的Mito-Tracker Green染色工作液,與細胞37 ℃共孵育30 min。孵育結束后,去除Mito-Tracker Green染色工作液,加入37 ℃預溫育的新鮮細胞培養液,用倒置熒光顯微鏡進行觀察。Mito-Tracker Green熒光強度定量分析使用Image J圖像分析軟件。

1.3.8 線粒體DNA拷貝數測定 將6孔板中培養的細胞處理為細胞懸液,使用基因組DNA提取試劑盒按照說明書方法提取細胞總DNA。通過RT-PCR檢測脂肪細胞線粒體基因ND1與核糖體蛋白RPLP0的含量。mtDNA相對拷貝數由線粒體DNA與核DNA之比確定,按2-ΔCT法計算[16,5]。

1.3.9 細胞中ATP含量測定 收集細胞到離心管內,棄上清,按照ATP含量試劑盒說明書詳細操作步驟進行測定。蛋白濃度用BCA蛋白分析試劑盒測定。最后以每毫克蛋白濃度校正ATP含量。

1.4 統計分析

采用Excel 2019對數據進行初步整理,所有結果以“平均值(mean)±標準誤(SEM)”表示。數據使用SPSS 23.0軟件先進行正態分布檢驗,符合正態分布后,使用One-way ANOVA分析不同亮氨酸濃度對細胞的影響,Duncan檢驗進行多重比較,獨立樣本T檢驗分析是否添加亮氨酸對細胞的影響。若不符合正態分布,使用非參數檢驗。P<0.05被認為具有顯著性差異。使用GraphPad Prism軟件8.0版進行圖像繪制。

2 結 果

2.1 前體脂肪細胞的形態學觀察及分化鑒定

如圖2A所示,分離所得的黃牛前體脂肪細胞呈長梭型。分化過程中,細胞收縮,形態由梭形向圓形轉變,部分細胞邊緣出現明亮脂滴。如圖2B所示,隨著分化時間的推進,細胞內脂滴數量增加,小脂滴逐漸融合成大脂滴,并與親脂染料油紅O結合。

A.黃牛前體脂肪細胞形態學觀察(100×);B.黃牛成熟脂肪細胞油紅O染色(200×)

2.2 亮氨酸對脂肪細胞活力的影響

不同濃度亮氨酸對黃牛皮下脂肪細胞活力的影響如圖3所示,與對照組相比,2和4 mmol·L-1亮氨酸添加顯著增加了脂肪細胞的活力(P<0.05),其他濃度亮氨酸添加對脂肪細胞的活力無顯著影響(P>0.05)。

與對照組相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下圖同

2.3 亮氨酸對白色脂肪細胞棕色化標志因子的影響

脂肪細胞中棕色化標志基因的表達水平如圖4所示,與對照組相比,2、4 mmol·L-1亮氨酸添加顯著提高了脂肪細胞中UCP1的mRNA相對表達量(P<0.05),2、4、8 mmol·L-1亮氨酸添加極顯著提高了脂肪細胞中PRDM16和TMEM26的mRNA相對表達量(P<0.01),4、8 mmol·L-1亮氨酸添加顯著提高了脂肪細胞中Cited1和Cidea的mRNA相對表達量(P<0.05)。其中,4 mmol·L-1亮氨酸添加對UCP1的mRNA相對表達量影響最為顯著,使其升高了5倍。因此選擇用4 mmol·L-1亮氨酸進行后續試驗。圖5中,Western Blot結果也證明4 mmol·L-1亮氨酸添加極顯著增加棕色化標志蛋白UCP1、CD137和SIRT1的蛋白表達量(P<0.01)。

圖5 亮氨酸對白色脂肪細胞棕色化標志蛋白表達量的影響

2.4 亮氨酸對脂肪細胞線粒體含量的影響

亮氨酸添加處理3 d后,通過Mito-tracker Green對線粒體染色,熒光顯微鏡觀察。如圖6A所示,亮氨酸添加后細胞內的綠色熒光強度相比于CON組明顯增強。熒光強度定量分析結果如圖6B所示,Leu組的綠色熒光強度增強至CON組的1.57倍(P<0.01)。說明亮氨酸添加顯著提高了細胞內線粒體數量。

A.脂肪細胞內線粒體綠色熒光探針染色(100×);B.Image J軟件分析熒光強度

2.5 亮氨酸對脂肪細胞線粒體生物合成和功能的影響

如圖7所示,相比于CON組,亮氨酸添加極顯著增加線粒體生物合成的關鍵基因SIRT1、TFAM、NRF1/2和Cytc的mRNA相對表達量(P<0.01),COX8b的mRNA相對表達量也呈現上調的趨勢(P<0.1)。亮氨酸添加極顯著增加了脂肪細胞內的mtDNA拷貝數(P<0.01),升高為CON組的1.24倍。此外,亮氨酸添加顯著降低了細胞內ATP的含量(P<0.05)。

A.脂肪細胞線粒體生物合成基因的mRNA相對表達量;B.脂肪細胞線粒體DNA拷貝數的相對表達水平;C.細胞內ATP含量

2.6 亮氨酸對脂肪細胞脂滴形態和脂質積累的影響

在前體脂肪細胞分化的第9天,同時也是亮氨酸添加的第3天,對細胞進行油紅O染色。結果如圖8所示,亮氨酸添加后大脂滴數量減少,細胞內脂滴多呈小串珠樣,呈環狀分布,脂滴形態從大型單房向小型多房轉變,符合棕色化脂肪細胞特征。染色后用異丙醇萃取油紅O染料,檢測脂肪細胞內甘油三酯的含量。亮氨酸添加后,脂肪細胞中甘油三酯含量降低為CON組的0.73倍(P<0.01)。

A.脂肪細胞油紅O染色(400×);B.異丙醇萃取量化細胞內甘油三酯含量

2.7 亮氨酸對脂肪細胞脂質代謝關鍵基因的影響

如圖9A所示,亮氨酸極顯著上調了β氧化過程中關鍵酶PPARα、ACOX1和CPT1的mRNA相對表達量(P<0.01)。亮氨酸對脂肪細胞脂質代謝關鍵基因表達的影響如圖9B所示。亮氨酸添加后,脂肪合成的關鍵酶ACC、FAS的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)。脂肪分解的關鍵酶HSL、ATGL的mRNA相對表達量極顯著增加(P<0.01)。結果表明,亮氨酸抑制脂肪合成,促進脂肪分解。

A.脂肪細胞脂肪酸β氧化基因的mRNA相對表達量;B.脂肪細胞脂肪合成和脂肪分解關鍵基因的mRNA相對表達量

2.8 亮氨酸對脂肪細胞AMPKα-PGC1α通路的影響

為了探究亮氨酸調控脂肪細胞棕色化和脂質代謝的機制,本試驗檢測了脂肪細胞AMPKα-PGC1α通路的基因和蛋白表達量。結果如圖10所示,與CON組相比,亮氨酸極顯著上調AMPKα1和PGC1α的mRNA 相對表達量(P<0.01);Western blot結果顯示,相比于CON組,亮氨酸添加極顯著上調p-AMPKα/AMPKα和PGC1α的蛋白表達量(P<0.01)。

圖10 亮氨酸對脂肪細胞脂肪AMPKα-PGC1α通路基因和蛋白表達的影響

3 討 論

前體脂肪細胞呈“成纖維”樣長梭形,本試驗分離出的黃牛皮下前體脂肪細胞形態與之相符[17-18]。前體脂肪細胞變為成熟脂肪細胞必須經過分化的過程,未添加亮氨酸處理的分化過程中,前體脂肪細胞內的甘油三酯含量逐漸增加。油紅O染料是一種強脂溶劑和染脂劑,能與細胞內甘油三酯結合,呈紅色小脂滴狀。本試驗分離的細胞與前體脂肪細胞形態相符,誘導分化后出現大量與油紅O染料結合的脂滴,說明成功分離黃牛皮下前體脂肪細胞且誘導分化成功。

線粒體內的解偶聯蛋白UCP1的高表達是棕色脂肪細胞和被活化的米色脂肪細胞最顯著的特征。區別于WA由Myf5-祖細胞發育而來,BA和肌細胞都來源于Myf5+祖細胞,在BA中,PRDM16的下調促使其轉變為肌細胞[19]。PRDM16能驅動脂肪細胞內棕色化和產熱基因程序性表達,被證實是棕色化的分子開關。TMEM26和CD137是米色脂肪細胞的標志性基因[20-21],CD137和TMEM26高表達的米色脂肪細胞伴隨著UCP1、PRDM16基因表達水平的增加[6]。Cidea也被證實是具有產熱能力的脂肪組織的標志物[22]。4 mmol·L-1亮氨酸顯著提高棕色化標志基因和蛋白的表達,證明亮氨酸具有促進白色脂肪細胞棕色化的作用。

線粒體是細胞進行氧化代謝活動、制造并釋放能量的細胞器,線粒體數量和活性的增加是白色脂肪細胞棕色化的重要特征,高線粒體含量促進BA的適應性產熱能力增強[23-24]。但是細胞不會產生新的線粒體,而是通過線粒體生物合成刺激健康的線粒體增殖[25]。Sun和Zemel[25]證明,0.5 mmol·L-1亮氨酸使C2C12肌肉細胞和3T3-L1脂肪細胞線粒體含量分別增加30%和53%。Schnuck等[26]也證實2 mmol·L-1亮氨酸顯著提高細胞內線粒體含量。本研究中,亮氨酸添加后脂肪細胞內的線粒體含量顯著增加。線粒體生物合成和增強線粒體功能的核心是激活PGC1ɑ。PGC1ɑ是線粒體基因轉錄共激活因子,調控下游核呼吸因子1/2(NRF1/2)。線粒體轉錄因子A(TFAM)是調節線粒體基因組轉錄的主要轉錄因子,受NRF1/2的調控[27]。因此PGC1α能誘導線粒體生物合成。試驗結果證明,亮氨酸顯著促進SIRT1、TFAM和NRF1/2等基因的表達,促進細胞內線粒體生物合成。mtDNA拷貝數是mtDNA在線粒體基因組中的個數,是反映線粒體生物合成的重要標志物之一。mtDNA拷貝數的增加也證實亮氨酸促進細胞內線粒體生物合成。解偶聯蛋白能消除細胞線粒體內膜兩側的H+濃度差,使氧化磷酸化與ATP生成過程解偶聯,進而產生熱能并影響ATP的生成[28]。本研究發現,亮氨酸誘導棕色化發生后,脂肪細胞內的ATP含量降低,與Zhang等[29]的研究結果一致。

棕色化發生后,脂肪細胞內脂滴形態發生相應變化,由單房大脂滴向多房小脂滴轉變。Choi等[30,21]證實3T3-L1細胞棕色化后,小脂滴數量增加,并呈環狀分布,甘油三酯含量顯著降低。本試驗發現,亮氨酸添加后脂肪細胞內的大脂滴數量減少,小脂滴數量增加,細胞內的甘油三酯含量也顯著減少,說明亮氨酸促進了棕色化現象的發生。

在細胞內,甘油三酯的合成和分解一直處于動態平衡。飼料中額外補充亮氨酸,能夠顯著降低肥胖小鼠白色脂肪組織的重量和脂肪細胞體積,顯著下調脂肪合成關鍵酶相關基因的表達,上調脂肪分解關鍵酶的基因表達[12]。楊江濤[31]也證明,亮氨酸顯著降低分化中的3T3-L1細胞PLIN蛋白表達,進而激活HSL磷酸化,促進脂肪分解。本研究發現,亮氨酸抑制脂肪合成,促進脂肪分解。脂肪酸β氧化速率的提高也是棕色和活化的米色細胞的特征之一[32]。ACOX1是過氧化體脂肪酸β氧化途徑中的第一個酶,CPT1介導脂肪酸進入線粒體的轉運,二者都是脂肪酸β氧化的關鍵限速酶。ACOX1由PPARα激活,介導能量消耗增加[33]。亮氨酸顯著促進脂肪酸β氧化關鍵酶的基因表達,促進細胞內脂肪酸β氧化。

AMPK是生物體內的重要能量代謝調節分子,Yang等[34]發現AMPKα1基因敲除小鼠顯著抑制了UCP1和PRDM16等棕色化標志基因和蛋白的表達,嚴重影響棕色脂肪的大小和產熱功能。Wu等[35]發現,AMPKα基因敲除小鼠棕色化基因表達量顯著降低,線粒體數量降低66%。AMPKα激動劑劑量依賴性地提高脂肪細胞中產熱基因的表達,并顯著上調細胞UCP1和線粒體生物合成的主要共調節因子PGC1α的蛋白表達水平。脂肪組織中主要表達的AMPKα1亞型被證明參與白藜蘆醇促進棕色脂肪細胞的形成和功能[36]。AMPKα作為PGC1ɑ的上游,也被確定為線粒體生物合成的主要調節因子[37]。因此,AMPK信號通路可刺激白色脂肪棕色化的發生,通過激活PGC1α促進白色脂肪細胞棕色化和線粒體生物合成。本研究發現,亮氨酸添加后p-AMPKα/AMPKα和PGC1α的蛋白表達量明顯提高,提示亮氨酸可能通過AMPKα/PGC1α信號途徑促進白色脂肪細胞棕色化。

4 結 論

亮氨酸能促使脂肪細胞大型單房形態脂滴向小型多房脂滴轉變,誘導黃牛脂肪細胞棕色化,促進細胞線粒體生物合成,促進脂肪分解并抑制脂肪合成,減少細胞內脂質沉積,并上調p-AMPKα/AMPKα和PGC1α的蛋白表達量。