基于中紅外光譜的牛奶中三種氨基酸含量預(yù)測(cè)模型的建立及應(yīng)用

褚 楚,張靜靜,丁 磊,樊懿楷,包向男,向世馨,劉 銳,羅雪路,任小麗,李春芳,劉文舉,王 亮,劉 莉,李永青,江 漢,李委奇,孫 偉,李喜和,溫 萬(wàn),周佳敏,張淑君*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070;2.內(nèi)蒙古國(guó)家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限責(zé)任公司,呼和浩特 011517;3.寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站,銀川 750000)

動(dòng)物攝取蛋白質(zhì)是為了獲得其中的氨基酸,尤其是對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要的必需氨基酸[1]。牛奶中的氨基酸組成與人奶相似,富含人體內(nèi)不能合成的必需氨基酸及3種支鏈氨基酸,是較為優(yōu)質(zhì)的乳蛋白資源[2]。其中,牛奶中富含的異亮氨酸(isoleucine,Ile)、精氨酸 (arginine,Arg)、組氨酸 (histidine,His)是成年人、兒童、早產(chǎn)兒重要的必需氨基酸,在人類(lèi)生命代謝中占有特別重要的地位。牛奶中的異亮氨酸占牛奶中總氨基酸含量的5.8%左右,具有提高機(jī)體免疫力[3]、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、激活抗氧化防御系統(tǒng)[4]、改善生長(zhǎng)性能、提高腸道免疫和物理屏障功能等重要生物功能[5]。牛奶中的組氨酸占奶中總氨基酸含量的2.6%左右,是處于生長(zhǎng)發(fā)育階段動(dòng)物非常重要的一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6],它在酶的活性部位發(fā)揮著特別重要的作用[7-8]。牛奶中的精氨酸占奶中總氨基酸含量的3.5%左右[9],研究發(fā)現(xiàn)攝入精氨酸可以改善機(jī)體免疫力[10]、促進(jìn)氨轉(zhuǎn)化成尿素進(jìn)而降低人體血氨,是維持嬰幼兒生長(zhǎng)和氮平衡必不可少的氨基酸[11]。因此,牛奶中游離氨基酸含量的準(zhǔn)確檢測(cè)有助于奶牛的健康養(yǎng)殖,同時(shí),也是穩(wěn)定乳制品質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化加工的前提。關(guān)于奶制品中游離氨基酸的測(cè)定方法目前暫無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)前用于游離氨酸含量檢測(cè)的分析技術(shù)主要有氨基酸自動(dòng)分析儀分析法、高效液相色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜儀[13]、氣相色譜-質(zhì)譜儀、毛細(xì)管電泳、核磁共振等,該技術(shù)測(cè)定準(zhǔn)確率較高,但此類(lèi)方法也存在成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、難操作和儀器設(shè)備要求高等不足,難以在奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定DHI的實(shí)踐中快速批量化使用[14-17]。中紅外光譜(mid-infrared spectroscopy,MIR)技術(shù)是一種非常經(jīng)濟(jì)高效的檢測(cè)工具,具有方便快捷、無(wú)污染、無(wú)破壞性、無(wú)前處理等優(yōu)勢(shì)[18],彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足,近年來(lái)已經(jīng)成為一種檢測(cè)趨勢(shì)。在定量分析過(guò)程中,中紅外光譜的靈敏度比其他光譜要高[19]。我國(guó)現(xiàn)已通過(guò)中紅外光譜技術(shù)對(duì)牛奶中蛋白總量和脂肪總量等常規(guī)乳成份指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),已廣泛應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)性能DHI測(cè)定中[20-21]。目前對(duì)牛奶中游離氨基酸含量的快速批量檢測(cè)方法研究較少,僅有一篇國(guó)外研究將MIR應(yīng)用于牛奶中游離氨基酸含量的定量檢測(cè),McDermott 等[22]利用來(lái)自7個(gè)研究牛群和69個(gè)商業(yè)牛群的715個(gè)奶樣建立了基于MIR的牛奶中游離氨基酸含量的定量模型,并探討了泌乳階段、胎次、月份、遺傳等對(duì)牛奶中游離氨基酸含量的影響。然而,目前尚無(wú)基于牛奶MIR的中國(guó)荷斯坦牛游離氨基酸含量的預(yù)測(cè)模型,也沒(méi)有我國(guó)奶牛群體氨基酸含量及其影響因素相關(guān)研究信息。

本研究利用中紅光譜MIR不同預(yù)處理方法、特征波段選擇算法及建模方法,建立中國(guó)荷斯坦牛牛奶中3種重要游離氨基酸(精氨酸、組氨酸、異亮氨酸)含量的MIR預(yù)測(cè)潛力模型,并將所建立的MIR預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于大規(guī)模奶牛奶數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè),從群體水平上探討牛奶中游離精氨酸、組氨酸和異亮氨酸含量,以及在不同胎次、泌乳階段、季節(jié)及牧場(chǎng)之間的變異特征。若MIR預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性良好,則將提供一種方法來(lái)估計(jì)大量牛奶中游離氨基酸含量,有望應(yīng)用于我國(guó)奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定DHI中,增加奶牛奶品質(zhì)性狀的表型指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從我國(guó)華北、華中和西北4個(gè)省份(A、B、C、D)的9個(gè)中國(guó)荷斯坦奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中,采集健康狀況良好的奶牛奶樣共217份,采樣時(shí)間為2018年10月至2019年1月。牛奶采集利用自動(dòng)擠奶裝置完成,奶樣一式兩份,一份用于MIR測(cè)定,一份用于氨基酸參考值測(cè)定,每份牛奶采集約40 mL,分裝到DHI檢測(cè)瓶中,依次編號(hào),并向每個(gè)采樣瓶里立即加入溴硝丙二醇防腐劑,緩慢搖晃使其充分溶解。運(yùn)回途中在奶樣周?chē)胖帽?2～4 ℃)防止變質(zhì),樣本到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行光譜采集。

1.2 儀器、設(shè)備和試劑

MilkoScanTMFT+[傅里葉變換中紅外光譜儀(FTIR),丹麥FOSS公司]; 全自動(dòng)氨基酸分析儀(德國(guó)SykamS433D);游離氨基酸分析柱(LCAK07/Li,4.6 mm ×150 mm);游離氨基酸分析除氨柱;針管過(guò)濾器;0.45 μm 尼龍濾膜;渦漩振蕩器;離心機(jī);進(jìn)樣瓶。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(34AA,PH游離,貨號(hào)AA-S000031);茚三酮(N105629-500 g,阿拉丁);緩沖液A、緩沖液B、緩沖液C、再生液D均購(gòu)于德國(guó)Sykam公司;LiOH×H2O;檸檬酸×H2O;HCl(濃度為37%);辛酸;磺基水楊酸;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方 法

1.3.1 中紅外光譜的采集 將采樣瓶放在42 ℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱15～20 min,將預(yù)熱后奶樣放在檢測(cè)鐵架上反轉(zhuǎn)搖晃數(shù)次使牛奶中成分分布均勻,在保持環(huán)境溫度為室溫的前提下,將樣品放上檢測(cè)履帶,打開(kāi)瓶蓋,依次通過(guò)FT-MIR儀進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果輸出牛奶MIR、牛奶常規(guī)乳成分(乳脂、乳蛋白、乳糖、尿素氮、總固形物)及牛奶體細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)。

1.3.2 牛奶中游離精氨酸、組氨酸和異亮氨酸的含量測(cè)定 1)100 nmol·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液配制:取100 μL標(biāo)準(zhǔn)液加900 μL樣品稀釋液,渦旋混勻。上機(jī)前用 0.45 μm尼龍濾膜過(guò)濾。2)奶樣的處理:吸取約8 mL奶樣于離心管中,3 000 r·min-1離心5 min(達(dá)到分離固態(tài)物的目的即可),若奶樣中懸浮物不至于干擾取樣均勻性,則此步驟可跳過(guò);離心后準(zhǔn)確吸取上清液1 mL于另外的離心試管中,加入2%磺基水楊酸9 mL,混勻靜置15 min;設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1離心20 min或10 000 r·min-1離心10 min,離心后取上清液;上機(jī)前用 0.45 μm 尼龍濾膜過(guò)濾。色譜條件:色譜柱:LCAK07/Li;流速:洗脫泵0.45 mL·min-1+衍生泵0.25 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):570 nm+440 nm;反應(yīng)器溫度:38～74 ℃梯度升溫;平均每批次檢測(cè)20個(gè)樣品,一批次只需進(jìn)樣一次標(biāo)準(zhǔn)液,若中途更換試劑(流動(dòng)相、茚三酮等)則標(biāo)準(zhǔn)液需重新進(jìn)樣。

1.4 異常值的篩選

首先去除光譜為空值的記錄,其次對(duì)真實(shí)值進(jìn)行篩選,即真實(shí)值在平均值±標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)則歸為正常值,否則為異常值。217條數(shù)據(jù)經(jīng)異常值篩選后,保留精氨酸數(shù)據(jù)185條,組氨酸數(shù)據(jù)197條,賴氨酸數(shù)據(jù)197條,具體信息見(jiàn)表1。

表1 牛奶樣本在不同地區(qū)的分布情況

1.5 光譜預(yù)處理、特征提取

牛奶膠束的散射以及儀器運(yùn)行過(guò)程中產(chǎn)生的隨機(jī)噪聲會(huì)對(duì)光譜造成干擾,因此光譜中不僅包含許多有用的化學(xué)信息,還存在大量的背景噪聲和無(wú)用信息。為去除光譜采集過(guò)程中環(huán)境、儀器及操作引起的系統(tǒng)誤差,正式建模前需先對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。本研究采用的光譜預(yù)處理方法包括標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation,SNV)、多元散射校正(multivariate scatter correction,MSC)、差分及Savitsky-Golay(SG)平滑(SG平滑包含w和k兩個(gè)參數(shù),w指窗口長(zhǎng)度,該值需為正奇整數(shù);k指對(duì)窗口內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行k階多項(xiàng)式擬合)。結(jié)果僅展示最優(yōu)光譜預(yù)處理。

牛奶MIR由925～5 008 cm-1范圍內(nèi)的1 060個(gè)單獨(dú)的波點(diǎn)組成,中紅外光譜特征維數(shù)較多,不同波段之間信息有一定的重疊性,通過(guò)特征提取算法,能夠大大降低光譜維數(shù),提高建模速度,并且可去除光譜中的噪音。本研究利用競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)算法(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)、遺傳算法(genetic algorithm,GA)及最小角回歸算法(least angle regression,LAR)提取特征變量,并與目前國(guó)際上牛奶MIR建模常用的274個(gè)信息波點(diǎn)(925～1 584 cm-1、1 719～1 784 cm-1及2 652～2 976 cm-1,以下稱為“信息波點(diǎn)”)相比較。

1.6 建 模

1.6.1 數(shù)據(jù)集劃分 根據(jù)4個(gè)地區(qū),將總數(shù)據(jù)集劃分為3部分,即訓(xùn)練集、測(cè)試集和外部驗(yàn)證集,三者數(shù)據(jù)比例約為4∶1∶1,訓(xùn)練集用于訓(xùn)練模型,測(cè)試集用于測(cè)試模型性能,外部驗(yàn)證集用于驗(yàn)證模型的泛化能力。在第一輪,A、B、C地區(qū)數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練集及測(cè)試集,D地區(qū)數(shù)據(jù)用于外部驗(yàn)證集;在第二輪,A、B、D地區(qū)數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練集及測(cè)試集,C地區(qū)數(shù)據(jù)用于外部驗(yàn)證集;以此類(lèi)推,直至每個(gè)地區(qū)的數(shù)據(jù)都用于一次外部驗(yàn)證。此過(guò)程不僅可了解模型對(duì)于建模地區(qū)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)力(測(cè)試集結(jié)果),還可了解其對(duì)其他地區(qū)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)能力(外部驗(yàn)證集結(jié)果)。

1.6.2 建模方法 本研究比較了兩種建模算法,即偏最小二乘回歸(partial least squares regression)及嶺回歸。

1.7 模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.8 模型的應(yīng)用

為探討模型的應(yīng)用性能,將預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于從E省(未參與建模的省份)9個(gè)不同奶牛場(chǎng)4 690頭牛采集的32 559個(gè)牛奶樣本的MIR光譜,去除光譜及常規(guī)乳成分空值、真實(shí)值范圍之外的異常值后獲得樣本23 707個(gè)。然后,通過(guò)比較氨基酸預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的差異、氨基酸與乳成分及體細(xì)胞數(shù)相關(guān)性的差異,進(jìn)一步確定模型在大規(guī)模數(shù)據(jù)集上外部驗(yàn)證的性能。最后,使用混合線性模型分析胎次、泌乳階段、季節(jié)(春季:3～5月;夏季:6～8月;秋季:9～11月;冬季:12月～次年2月)及牧場(chǎng)對(duì)牛奶中游離精氨酸、組氨酸及異亮氨酸含量的影響,以探討模型的預(yù)測(cè)應(yīng)用效果:

yijklmn=DIMi+Parityj+Seasonk+Herdl+Cowm+eijklmn

其中,yijklmn為分析的3種氨基酸性狀表型,包括精氨酸、組氨酸和異亮氨酸;DIMi為第i水平DIM的固定效應(yīng)(i=1,2,…,12,以30 d為間隔分為12個(gè)水平,其中第12類(lèi)包括DIM>330 d的樣本);Parityj是奶牛的第j胎的固定效應(yīng)(j=1:第一胎次;j=2:第2胎次;j=3:第3胎次;j=4:第4胎次;j=5:第5胎次;j=6:第6及后胎次);Seasonk是季節(jié)固定效應(yīng)(k=1:春季;k=2:夏季;k=3:秋季;k=4:冬季);Herdl是第l個(gè)牧場(chǎng)的隨機(jī)效應(yīng)(l=1～9);Cowm是奶牛個(gè)體的隨機(jī)效應(yīng);eijklmn為隨機(jī)殘差,假設(shè)服從eijklmn～N(0,σe2)正態(tài)分布,其中σe2是殘差方差。

2 結(jié) 果

2.1 牛奶的中紅外光譜MIR特征

牛奶的原始光譜如圖1所示。牛奶MIR由925～5 008 cm-1范圍內(nèi)的1 060個(gè)單獨(dú)的波點(diǎn)組成,共包含5個(gè)區(qū)域,大致分為短波紅外區(qū)(SWIR)、中波紅外區(qū)(MWIR)和長(zhǎng)波紅外區(qū)(LWIR)。5 010～3 673 cm-1被稱為SWIR區(qū)域,此區(qū)域通常被認(rèn)為與牛奶成分的化學(xué)鍵無(wú)關(guān)[24-25];3 669～3 052 cm-1被稱為SWIR-MWIR區(qū)域;3 048～1 701 cm-1被稱為MWIR-1區(qū)域,此區(qū)域與C-H,C=O,C-N和N-H鍵有關(guān),所有這些鍵均與乳脂含量有關(guān)[26];1 698～1 585 cm-1被稱為MWIR-2區(qū)域;1 582～925 cm-1被稱為MWIR-LWIR區(qū)域,此區(qū)域被稱為“指紋區(qū)”,該區(qū)域通常被認(rèn)為是預(yù)測(cè)牛奶成分最重要的區(qū)域,因?yàn)樗c化學(xué)鍵C-H,芳香族C=C,C-O和N-O有關(guān)[27]。不同樣本在MWIR-2(1 698～1 585 cm-1)及SWIR-MWIR(3 669～3 052 cm-1)區(qū)域吸光度的變異很大,這是由水吸收導(dǎo)致,一般認(rèn)為,水吸收區(qū)域不含信息特征,因此來(lái)自吸水區(qū)域的波數(shù)通常被認(rèn)為不能用于預(yù)測(cè)牛奶成分或任何其他特性[28]。在MWIR-1區(qū)域及MWIR-LWIR區(qū)域均觀察到特征吸收峰,在SWIR區(qū)域未觀察到特征吸收峰。

SWIR.短波紅外或近紅外區(qū)域;MWIR.中波紅外區(qū)域(3.0～8.0 μm);LWIR.長(zhǎng)波紅外區(qū)域(8.0～15.0 μm)

2.2 基于牛奶MIR的3種氨基酸預(yù)測(cè)模型的建立

利用兩種建模算法、3種波段選擇算法及4種光譜預(yù)處理算法對(duì)牛奶中游離精氨酸、組氨酸及異亮氨酸分別建立基于MIR的預(yù)測(cè)模型,模型結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同建模算法及特征選擇方法對(duì)氨基酸預(yù)測(cè)模型性能的影響

2.2.1 光譜預(yù)處理、特征選擇算法及建模算法的選擇 建模前,使用CARS、GA和LAR算法分別對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取,分別找出能夠代表精氨酸、組氨酸、異亮氨酸含量的特征變量,然后利用SG平滑、差分、MSC、SNV方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。

對(duì)于精氨酸,利用CARS算法提取到的光譜特征建模效果好(RP2=0.58),其次是274個(gè)信息波點(diǎn)(RP2=0.50),GA和LAR算法表現(xiàn)出相似的結(jié)果(RP2=0.45)。對(duì)于組氨酸,表現(xiàn)出和精氨酸類(lèi)似的規(guī)律,即CARS算法(RP2=0.56)優(yōu)于274個(gè)信息波點(diǎn)(RP2=0.50)建模,GA(RP2=0.34)和LAR(RP2=0.47)算法差于274個(gè)信息波點(diǎn)建模。對(duì)于異亮氨酸,利用274個(gè)特征信息波點(diǎn)(RP2=0.49)建模效果最好,優(yōu)于CARS(RP2=0.38)、GA(RP2=0.32)及LAR(RP2=0.28)。3種氨基酸建模最優(yōu)波段在MIR上的分布范圍如下:精氨酸經(jīng)過(guò)CARS算法共選擇出71個(gè)波點(diǎn):9個(gè)分布在MWIR-1區(qū)域、5個(gè)分布在MWIR-2區(qū)域;13個(gè)分布在MWIR-LWIR區(qū)域、26個(gè)分布在SWIR區(qū)域、18個(gè)分布在SWIR-MWIR區(qū)域。組氨酸經(jīng)過(guò)CARS算法共選擇出93個(gè)波點(diǎn):27個(gè)分布在MWIR-1區(qū)域、2個(gè)分布在MWIR-2區(qū)域;26分分布在MWIR-LWIR區(qū)域;16個(gè)分布在SWIR區(qū)域、22個(gè)分布在SWIR-MWIR區(qū)域。目前,國(guó)際上牛奶MIR建模常用的274個(gè)信息波點(diǎn)分布在925～1 584 cm-1、1 719～1 784 cm-1及2 652～2 976 cm-1范圍內(nèi),包含了MWIR-1中的乳脂吸收區(qū)及MWIR-LWIR(牛奶指紋)區(qū)域。

從表2可以看出,與嶺回歸相比,利用PLSR算法建立精氨酸、組氨酸和異亮氨酸模型效果較好,此類(lèi)模型的R2及RPD較高、RMSE及MAE較低。綜上所述,采用CARS特征選擇算法+無(wú)光譜預(yù)處理+PLSR建模算法開(kāi)發(fā)的精氨酸含量預(yù)測(cè)模型效果最好,該模型RP2=0.58,RMSEp=6.89 nmol·mL-1,MAE=5.64 nmol·mL-1,RPD=1.41;采用CARS特征選擇算法+SG平滑(窗口長(zhǎng)度為11,2階多項(xiàng)式)預(yù)處理+PLSR建模算法開(kāi)發(fā)的組氨酸含量預(yù)測(cè)模型效果最好,該模型RP2=0.56,RMSEp=0.88 nmol·mL-1,MAE=0.70 nmol·mL-1,RPD=1.63;采用274個(gè)特征信息波點(diǎn)+SG平滑(窗口長(zhǎng)度為29,3階多項(xiàng)式)預(yù)處理+PLSR建模算法開(kāi)發(fā)的異亮氨酸含量預(yù)測(cè)模型效果最好,該模型RP2=0.49,RMSEp=1.75 nmol·mL-1,MAE=1.34 nmol·mL-1,RPD=1.55。

2.2.2 預(yù)測(cè)最優(yōu)模型的跨地區(qū)外部驗(yàn)證 利用所建立的最優(yōu)預(yù)測(cè)模型對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的未參加建模的奶牛奶進(jìn)行外部驗(yàn)證,以探討建立的氨基酸預(yù)測(cè)模型對(duì)其他地區(qū)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)能力,即跨地區(qū)預(yù)測(cè)能力。由表3可看出,數(shù)據(jù)集的劃分不同,模型的外部驗(yàn)證結(jié)果略有差異,對(duì)于精氨酸、組氨酸和異亮氨酸,跨地區(qū)外部驗(yàn)證的預(yù)測(cè)誤差分別為7.70～10.11 nmol·mL-1,1.22～1.49 nmol·mL-1,2.01～2.76 nmol·mL-1。由圖2可看出,真實(shí)值和預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖圍繞在y=x(真實(shí)值等于預(yù)測(cè)值),表明在小規(guī)模數(shù)據(jù)集上,跨不同地區(qū)外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值呈現(xiàn)出一定的相關(guān)趨勢(shì)。

a.A、B、C地區(qū)數(shù)據(jù)建模,D地區(qū)數(shù)據(jù)做外部驗(yàn)證(最優(yōu)模型外部驗(yàn)證結(jié)果);b.A、B、D地區(qū)數(shù)據(jù)建模,C地區(qū)數(shù)據(jù)做外部驗(yàn)證(最優(yōu)模型外部驗(yàn)證結(jié)果);c.A、C、D地區(qū)數(shù)據(jù)建模,B地區(qū)數(shù)據(jù)做外部驗(yàn)證(最優(yōu)模型外部驗(yàn)證結(jié)果);d.C、D、B地區(qū)數(shù)據(jù)建模,A地區(qū)數(shù)據(jù)做外部驗(yàn)證(最優(yōu)模型外部驗(yàn)證結(jié)果)

表3 最優(yōu)模型的跨地區(qū)驗(yàn)證

綜合模型在跨不同地區(qū)外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集上的預(yù)測(cè)誤差及相關(guān)關(guān)系結(jié)果,表明目前建立的氨基酸最優(yōu)預(yù)測(cè)模型可用于區(qū)分高氨基酸含量牛奶及低氨基酸含量牛奶,即分析氨基酸含量高低趨勢(shì),可用于奶牛性能高低評(píng)估,若模型用于較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)真實(shí)含量還需要進(jìn)一步優(yōu)化和提高。

2.3 模型在9大規(guī)模牧場(chǎng)中預(yù)測(cè)應(yīng)用

為了進(jìn)一步探討模型對(duì)牛場(chǎng)大規(guī)模奶牛群牛奶的預(yù)測(cè)應(yīng)用效果,利用建立的最優(yōu)精氨酸、組氨酸、異亮氨酸含量預(yù)測(cè)模型對(duì)來(lái)自沒(méi)有參加建模的另外9個(gè)不同奶牛場(chǎng)(位于E省)的4 690頭牛采集的32 559個(gè)牛奶樣本的MIR光譜進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2.3.1 模型預(yù)測(cè)的氨基酸含量及其高低趨勢(shì) “2.2.2”說(shuō)明了基于MIR的氨基酸含量預(yù)測(cè)模型對(duì)氨基酸含量高低趨勢(shì)具有一定的預(yù)測(cè)潛力。由表4可知,在進(jìn)行跨不同地區(qū)或牧場(chǎng)的外部驗(yàn)證時(shí),3種氨基酸含量的預(yù)測(cè)值略低于真實(shí)值,但在含量值的高低趨勢(shì)是相似的,精氨酸含量最高,其次是異亮氨酸,組氨酸的含量最低。

表4 牛奶中游離氨基酸真實(shí)值及預(yù)測(cè)值的含量及分布情況

2.3.2 模型預(yù)測(cè)的氨基酸含量與牛奶常規(guī)乳成分相關(guān) 3種氨基酸預(yù)測(cè)值與牛奶常規(guī)乳成分和體細(xì)胞數(shù)及產(chǎn)奶量的相關(guān)性同3種氨基酸測(cè)定真實(shí)值與牛奶常規(guī)乳成分和體細(xì)胞數(shù)及產(chǎn)奶量的相關(guān)性相比,均呈現(xiàn)相同的正相關(guān)或負(fù)相關(guān),預(yù)測(cè)值與牛奶常規(guī)乳成分(牛奶常規(guī)乳成分、體細(xì)胞數(shù)、產(chǎn)奶量)的相關(guān)強(qiáng)度略低于真實(shí)值與三者的相關(guān)強(qiáng)度(圖3)。綜合以上結(jié)果,建立的預(yù)測(cè)模型具有預(yù)測(cè)奶牛氨基酸含量及其變化趨勢(shì)的潛力。

左側(cè)圖代表3種氨基酸預(yù)測(cè)值與牛奶常規(guī)乳成分、體細(xì)胞數(shù)、產(chǎn)奶量的相關(guān)性;右側(cè)圖代表3種氨基酸真實(shí)值與牛奶常規(guī)乳成分、體細(xì)胞數(shù)、產(chǎn)奶量的相關(guān)性;不顯著相關(guān)性系數(shù)圖塊上有X符號(hào)

2.3.3 模型預(yù)測(cè)氨基酸含量的影響因素 經(jīng)過(guò)混合線性模型分析可知,泌乳階段、牧場(chǎng)、季節(jié)對(duì)牛奶中游離精氨酸、組氨酸及異亮氨酸含量均有極顯著影響(P<0.001),而胎次對(duì)精氨酸含量無(wú)顯著影響,對(duì)組氨酸和異亮氨酸有極顯著影響(P<0.001)(表5)。

表5 混合線性模型分析結(jié)果

圖4A展示了泌乳階段對(duì)牛奶中精氨酸、異亮氨酸及組氨酸含量的影響。共觀察到兩種變化規(guī)律,第一個(gè)對(duì)應(yīng)異亮氨酸和組氨酸,在泌乳前2個(gè)月含量降低,隨后小幅度增加,至泌乳6個(gè)月后又有降低趨勢(shì),在后期趨于穩(wěn)定;第二種變化規(guī)律對(duì)應(yīng)精氨酸,在泌乳前期和中期(1～9月)牛奶中精氨酸含量不斷升高,泌乳9～11月略微降低,隨后又轉(zhuǎn)為上升趨勢(shì)。圖4B可看出,不同牧場(chǎng)之間氨基酸含量有差異,令人感興趣的是,精氨酸和異亮氨酸在不同牧場(chǎng)之間的變化規(guī)律幾乎相同,而組氨酸表現(xiàn)出與二者完全相反的變化規(guī)律。由圖4C可知,隨著從低胎次到高胎次的過(guò)渡,牛奶中精氨酸、異亮氨酸和組氨酸含量有降低趨勢(shì),但變化不明顯,差異不顯著。圖4D展現(xiàn)了牛奶中精氨酸、異亮氨酸和組氨酸含量在不同季節(jié)中的變化。精氨酸、組氨酸和異亮氨酸對(duì)于季節(jié)的變化響應(yīng)了相似的變化規(guī)律,即春季到秋季含量升高,在秋季含量到達(dá)頂峰,隨后降低。3種氨基酸的最高值均出現(xiàn)在秋季,精氨酸的最低值出現(xiàn)在春季,異亮氨酸和組氨酸的最低值出現(xiàn)在冬季。

3 討 論

3.1 基于牛奶MIR的3種氨基酸預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性

本研究利用不同的特征選擇方法、光譜預(yù)處理方法及建模算法建立了基于MIR的牛奶(原料牛奶)中游離精氨酸、組氨酸和異亮氨酸含量的預(yù)測(cè)模型,三者最優(yōu)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)性能相似,RP2均在0.5左右(0.58、0.56、0.49),RPD在1.5左右(1.41、1.63、1.55),預(yù)測(cè)誤差RMSEp也在預(yù)期范圍內(nèi)(6.89、0.88、1.75 nmol·mL-1),這些結(jié)果表明,雖然建立的氨基酸預(yù)測(cè)模型目前不能進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測(cè),但可用于預(yù)測(cè)牛奶中的氨基酸含量,鑒別高游離氨基酸牛奶和低游離氨基酸牛奶,即用于牛奶氨基酸含量高低趨勢(shì)分析,也可用于奶牛的品質(zhì)性狀指標(biāo)氨基酸含量預(yù)測(cè)及其高低的比較。

目前,國(guó)內(nèi)外僅有一篇文獻(xiàn)研究MIR對(duì)牛奶中游離氨基酸含量的定量預(yù)測(cè),McDermott 等[22]使用PLSR方法,利用712個(gè)奶樣的MIR及參考值建立了牛奶中游離總氨基酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸及纈氨酸含量的定量預(yù)測(cè)模型,驗(yàn)證集中相關(guān)系數(shù)為0.26(精氨酸)～0.75(甘氨酸)(對(duì)應(yīng)R2為0.07～0.56),RPD為1.07(絲氨酸)～1.38(甘氨酸),此研究與本研究只有一種相同氨基酸,即精氨酸。與McDermott 等[22]的研究(r=0.26,R2=0.07,RPD=1.25)相比,本研究建立的游離精氨酸定量預(yù)測(cè)模型(驗(yàn)證集R2=0.58,RPD=1.41)結(jié)果較好。對(duì)于精氨酸含量預(yù)測(cè)模型的建立過(guò)程,本研究與McDermott 等[22]均使用了PLSR建模算法,且并未對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理,造成預(yù)測(cè)效果有差異的可能原因有光譜預(yù)處理方法、特征波選擇方法、建模數(shù)據(jù)量、樣本采集廣泛度(多樣性和代表性)、建模集中測(cè)試集與訓(xùn)練集的分布情況、真實(shí)值的測(cè)定過(guò)程、牧場(chǎng)的飼養(yǎng)管理等[29]。McDermott 等[22]使用的波段范圍為 926～1 580 cm-1、1 717～2 986 cm-1、3 696～3 808 cm-1(僅去除了水吸收區(qū)域),而本研究結(jié)合3種波段選擇算法(GA、LAR、CARS)選出了最優(yōu)預(yù)測(cè)模型,Gottardo等[30]表明,在PLS分析之前采用變量選擇方法可以提高牛奶中脂肪酸組成的預(yù)測(cè)精度。

當(dāng)將建立的預(yù)測(cè)模型應(yīng)用到跨不同地區(qū)外部驗(yàn)證集中時(shí),由于不同地區(qū)氣候、牧場(chǎng)管理?xiàng)l件、奶牛飲食等均有差異,導(dǎo)致外部驗(yàn)證集的變異性未包含在建模集中,因此模型對(duì)外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)產(chǎn)生了有偏預(yù)測(cè),這是預(yù)期內(nèi)的結(jié)果,有文獻(xiàn)表明,對(duì)于準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)方程,驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中存在的變化必須包含在校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集中[31-32],因此,為建立穩(wěn)健準(zhǔn)確的氨基酸預(yù)測(cè)模型,需要在模型中加入來(lái)源于不同飼養(yǎng)條件、飲食、品種、氣候等的氨基酸數(shù)據(jù),以在建模集中包含足夠多的變異,這可以通過(guò)跨地區(qū)及國(guó)際合作實(shí)現(xiàn)。

3.2 泌乳階段、牧場(chǎng)、胎次及季節(jié)對(duì)模型預(yù)測(cè)的精氨酸、組氨酸及異亮氨酸含量的影響

奶牛的泌乳階段可分為泌乳初期、泌乳前期、泌乳中期、泌乳后期、干奶期5個(gè)階段,泌乳階段不同,奶產(chǎn)量及牛奶中氨基酸含量也會(huì)有所差異。相關(guān)文獻(xiàn)表明,牛奶中游離氨基酸含量在泌乳初期和泌乳后期較高。McDermott 等[22]利用基于MIR的牛奶中游離氨基酸含量模型預(yù)測(cè)了大量比利時(shí)DHI數(shù)據(jù),結(jié)果表明牛奶中總游離氨基酸含量與大多數(shù)游離氨基酸含量(谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸和天冬氨酸)在泌乳早期降低,直到產(chǎn)犢后第65天,隨后逐漸升高,這與本研究結(jié)果(精氨酸從泌乳前期到后期均有上升趨勢(shì))有所差異,產(chǎn)生差異的原因可能是本研究建模數(shù)據(jù)中泌乳早期數(shù)據(jù)較少,因此對(duì)于泌乳早期會(huì)產(chǎn)生較大誤差的預(yù)測(cè),更重要原因可能與奶牛飼料、飼養(yǎng)管理和季節(jié)等因素有關(guān)。

季節(jié)對(duì)牛奶氨基酸含量的影響有多方面,主要是不同季節(jié)導(dǎo)致飼草營(yíng)養(yǎng)成份[33]、空氣溫度等發(fā)生變化,因此,在生產(chǎn)中為了得到質(zhì)量更優(yōu)的奶產(chǎn)品,對(duì)奶牛養(yǎng)殖要注意營(yíng)養(yǎng)水平及溫度的調(diào)控,在夏季防暑降溫至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明,牛奶中精氨酸含量在秋季最高,春夏季含量較低,這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[34]。奶牛屬于耐冷不耐熱的動(dòng)物,在較高溫的環(huán)境中具有較低的生產(chǎn)性能,因此夏季牛奶中氨基酸含量降低。有學(xué)者以荷斯坦奶牛為研究對(duì)象,探討荷斯坦牛奶中氨基酸含量的季節(jié)變化特點(diǎn),結(jié)果表明隨著返青期、盛草期、枯草前期和枯草期等季節(jié)的更替,牛奶中總氨基酸和必需氨基酸的含量呈遞增趨勢(shì)。在返青期,牧草水分含量較高,干物質(zhì)較少,以此為飼料生產(chǎn)的牛奶表現(xiàn)出較低氨基酸含量的特點(diǎn);盛草期牧草快速生長(zhǎng),干物質(zhì)含量迅速升高,奶牛粗纖維、粗脂肪、粗蛋白攝入量增多,為乳腺細(xì)胞合成蛋白質(zhì)提供較為充足的原料,因此盛草期間牛奶中氨基酸含量較返青期高;隨著枯草期的到來(lái),牧草中粗纖維含量升高,導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低而乳脂率升高,進(jìn)而提高牛奶中氨基酸含量[35]。

胎次是影響牛奶營(yíng)養(yǎng)成份、奶牛生產(chǎn)性能和血液指標(biāo)的重要因素,同時(shí)對(duì)牛奶氨基酸含量也有較大影響。牛奶中各游離氨基酸含量和游離氨基酸總量在奶牛第1胎時(shí)最高[22],且隨胎次的增長(zhǎng)有明顯下降的趨勢(shì),這與本研究結(jié)果一致。隨奶牛胎次的增長(zhǎng)其奶中氨基酸含量降低的原因可能是頭胎泌乳牛較為健康,患乳腺炎的較少,往后的胎次由于飼養(yǎng)管理、環(huán)境等原因會(huì)發(fā)生乳腺疾病,從而導(dǎo)致牛奶中氨基酸和蛋白質(zhì)含量的下降[36]。以上分析的不同影響因素對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果影響效應(yīng)與變化規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似,從另一個(gè)角度也說(shuō)明該模型具有一定的預(yù)測(cè)能力。

4 結(jié) 論

本研究在國(guó)內(nèi)率先利用MIR建立牛奶中3種氨基酸含量的預(yù)測(cè)模型,結(jié)果表明MIR有預(yù)測(cè)牛奶中游離精氨酸、組氨酸和異亮氨酸的潛力,特別是在牛奶氨基酸含量高低趨勢(shì)分析以及奶牛的品質(zhì)性狀指標(biāo)氨基酸含量預(yù)測(cè)及其高低比較方面具有一定預(yù)測(cè)能力。然而,所建立的模型還需要更多有代表性樣本進(jìn)行優(yōu)化和提高,以進(jìn)行較精準(zhǔn)定量檢測(cè)牛奶中3種氨基酸含量。大規(guī)模牛奶樣本預(yù)測(cè)結(jié)果表明了牛奶中游離精氨酸、組氨酸和異亮氨酸預(yù)測(cè)值在不同泌乳階段、胎次、季節(jié)和牧場(chǎng)中的變化趨勢(shì):牛奶中游離氨基酸含量預(yù)測(cè)值在秋季最高,精氨基酸含量在整個(gè)泌乳期呈上升趨勢(shì),精氨酸和組氨酸及異亮氨酸含量均隨胎次有降低的趨勢(shì)。