β-煙酰胺單核苷酸對牛卵母細胞脂滴含量及冷凍效果的影響

徐 茜,楊柏高,張 航,馮肖藝,郝海生,杜衛華,朱化彬,張培培,趙學明

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

然而,大量研究表明,由于冷凍會引起質膜破裂[13-17]、活性氧升高[18]、凋亡增加[19]、紡錘體[20]、內質網和線粒體等細胞器功能異常[21-22]等一系列細胞損傷,冷凍卵母細胞的發育能力仍低于新鮮卵母細胞[13-15]。眾多研究指出,脂質含量過高是引起家畜卵母細胞冷凍效果下降的重要原因[23-25]。牛卵母細胞中脂質含量非常豐富,是小鼠的2.8倍[26]。卵母細胞中豐富的脂質主要以三酰甘油的形式儲存于脂滴中[27]。在冷凍降溫過程中,脂質易發生脂質相變[28-30]和脂質過氧化[31],導致內質網、線粒體等細胞器損傷[32],降低卵母細胞發育能力[28,33-34]。另外,多項研究表明,通過離心和顯微操作方法或添加化學物質降低卵母細胞脂質含量后,其冷凍后發育能力有所提高[35-37]。由此可見,冷凍前降低脂質含量是提高家畜卵母細胞冷凍效率的有效途徑。

β-煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是一種具有生物活性的核苷酸[38]。在哺乳動物體內,NMN是合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的主要前體物質之一[38],可通過補充NAD+水平參與能量代謝[39]、應激反應[40]、DNA損傷修復[41]和基因表達[42]等重要生理過程。據報道,NMN對糖尿病[43]、肥胖[44]、非酒精性脂肪肝[45]、腦損傷[46]、衰老[39,47]等疾病均有顯著的改善作用。近年來,有研究指出,NMN可以促進細胞脂質代謝,對細胞脂質沉積也具有顯著的抑制效果[48],但其對牛卵母細胞是否具有同樣的作用仍有待驗證。

因此,本試驗通過在體外成熟液中添加NMN,對牛卵母細胞進行體外成熟(invitromaturation,IVM)培養,并對牛卵母細胞脂滴含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、細胞凋亡水平、冷凍-解凍后存活率以及囊胚發育率進行檢測,以探究NMN對牛卵母細胞脂滴含量及冷凍效果的影響,以期為提高牛卵母細胞的冷凍效率奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗分組

本試驗主要分組如下:體外成熟液未添加NMN為新鮮對照組(fresh control)、體外成熟液添加NMN為NMN組(NMN)、體外成熟液未添加NMN但進行玻璃化冷凍作為玻璃化對照組(vitrification control)、體外成熟液添加NMN且進行玻璃化作為NMN玻璃化組(NMN + vitrification)。

1.2 主要試劑

除特別說明外,本試驗所用試劑均采購自Sigma公司。TCM-199和胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司。NMN和尼羅紅染料購自北京索萊寶科技有限公司。ROS檢測試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵母細胞采集與IVM 本試驗所用卵母細胞均來自屠宰場所屠宰動物的卵巢。將屠宰場卵巢置于含青鏈霉素的37 ℃生理鹽水中,2 h內運送到實驗室。從直徑為2～8 mm的卵泡中抽取卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes,COCs),置于體式顯微鏡下挑選至少含有3層卵丘細胞的COCs用于后續試驗。將符合標準的COCs放入含體外成熟液的4孔板中(50個·孔-1),置于38.5 ℃,5% CO2培養箱中成熟22～24 h。本試驗中,NMN濃度為1 μmol·L-1,對照組不添加NMN。

1.3.2 玻璃化冷凍與解凍 根據Zhao等[49]的方法,采用OPS管進行玻璃化冷凍。將卵母細胞置于預處理液中孵育30 s,轉入冷凍液中,并迅速吸入OPS管中,25 s內投入液氮中。玻璃化冷凍溶液根據Hou等[50]的方法配制并稍作改動。預處理液配制:DMSO∶EG∶FBS∶DPBS按1∶1∶1∶7(v/v)配制。玻璃化冷凍液配制:DMSO∶EG∶FSF按照2∶2∶6(v/v)配制,其中FSF由DPBS、0.5 mol·L-1蔗糖、300 g·L-1聚蔗糖、20% FBS組成。

解凍處理:從液氮中取出OPS管,快速將卵母細胞吹入0.5 mol·L-1蔗糖溶液中,孵育5 min,再轉移至0.25 mol·L-1蔗糖溶液中,孵育5 min。將解凍后的卵母細胞置于10% FBS-M199中洗滌3次,放入38.5 ℃,5% CO2培養箱中靜置1.5～2 h,恢復細胞形態,挑選細胞形態完整、正常的卵母細胞用于后續試驗。

1.3.3 體外受精 根據Brackett和Oliphant[51]的方法稍作改動,進行卵母細胞體外受精操作。首先,將成熟后的卵母細胞置于1 mg·mL-1的透明質酸酶溶液中,反復吹打,脫去多余的顆粒細胞,僅保留1～2層。隨后,將凍精置于38 ℃水浴解凍,7 mL洗精液洗滌兩次,離心條件為1 800 r·min-1,5 min。精子沉淀用受精液重懸,調整精子密度為5×106個·mL-1。取20 μL重懸的精液與80 μL受精液混勻,制備成受精滴,放入恒溫培養箱平衡1.5 h。將卵母細胞轉移至受精滴中,放入38.5 ℃、5% CO2培養箱中,培養16～18 h。受精結束后的受精卵轉移至胚胎前期培養液中繼續培養,48 h后統計卵裂率,并轉入后期培養液中繼續培養,每隔48 h半量換液,直到受精后第7天(受精當天為第0天),統計囊胚率。

2)第2種是發射技術，該方法屬于被動探測法(圖1b)，即用于探測煤巖物理力學信息的聲波源不是人工激發的，而是煤巖體在受力破壞過程中自發產生，根據煤巖體聲發射的頻率和能量等信息可以了解其受力破壞狀態及過程。

1.3.4 脂滴含量檢測 成熟22～24 h后,將COCs置于1 mg·mL-1的透明質酸酶溶液中,反復吹打,脫去顆粒細胞。卵母細胞置于0.1% PVA-PBS溶液中清洗3次,置于10 μg·mL-1尼羅紅染色液中,37 ℃,避光染色10 min。隨后,卵母細胞用0.1% PVA-PBS溶液清洗3次,置于倒置熒光顯微鏡(尼康,日本)下拍照。采集的熒光圖像利用 EZ-C1 Free Viewer software (尼康,日本)軟件進行熒光值統計。

1.3.5 ROS檢測 成熟22～24 h后,將COCs置于1 mg·mL-1的透明質酸酶溶液中,反復吹打,脫去顆粒細胞。根據制造商說明書,利用活性氧檢測試劑盒(S0033 S,碧云天)檢測卵母細胞ROS水平。卵母細胞經0.1% PVA-PBS洗滌3次后,置于10 mmol·L-1DCFH-DA染色液中,37 ℃避光染色20 min。染色完成后,卵母細胞用0.1% PVA-PBS溶液清洗3次,置于倒置熒光顯微鏡(尼康,日本)下拍照。采集的熒光圖像利用EZ-C1 Free Viewer software (尼康,日本)進行熒光值統計。

1.3.6 細胞凋亡檢測 成熟22～24 h后,將COCs置于1 mg·mL-1的透明質酸酶溶液中,反復吹打,脫去顆粒細胞。根據制造商說明書,利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062 M,碧云天)檢測卵母細胞早期凋亡水平。首先,根據說明書將Annexin V-FITC、碘化丙啶染色液和Annexin V-FITC結合液混勻,制備成100 μL染色滴。隨后,將卵母細胞用0.1% PVA-PBS洗滌3次后,轉移至染色滴中,室溫,避光染色20 min。染色完成后,卵母細胞用0.1% PVA-PBS溶液清洗3次,置于倒置熒光顯微鏡(尼康,日本)下拍照。

1.4 數據統計與分析

本試驗均重復3次。采用SAS8.2軟件進行單因素方差分析,并使用Duncan′s 檢驗法進行顯著性分析,結果以“平均數±標準差”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 NMN對牛卵母細胞脂滴含量的影響

為了研究NMN對牛卵母細胞脂滴含量的影響,本研究采用尼羅紅染料檢測了牛卵母細胞脂滴含量的變化。圖1A和1B分別為新鮮對照組和NMN組卵母細胞的脂滴染色圖。如圖1C所示,與新鮮對照組相比,NMN組的脂滴熒光強度顯著降低(P<0.05),表明IVM期間添加NMN可以有效降低牛卵母細胞脂滴含量。

A.新鮮對照組卵母細胞脂滴尼羅紅熒光圖像,標尺=20 μm;B.NMN處理組卵母細胞脂滴尼羅紅熒光圖像,標尺=20 μm;C.卵母細胞脂滴熒光值。不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2 NMN對牛卵母細胞ROS水平的影響

為了研究NMN對牛卵母細胞ROS水平的影響,本研究采用ROS檢測試劑盒檢測了牛卵母細胞ROS水平。牛卵母細胞DCFH-DA熒光染色圖像如圖2A所示。由圖2B可知,NMN組牛卵母細胞的DCFH-DA熒光強度顯著低于新鮮對照組(P<0.05),并且NMN玻璃化組卵母細胞DCFH-DA熒光強度也顯著低于玻璃化對照組(P<0.05),說明IVM期間添加NMN能有效降低牛卵母細胞ROS水平。

A.卵母細胞DCFH-DA熒光圖像,標尺=100 μm;B.卵母細胞DCFH-DA熒光值

2.3 NMN對牛卵母細胞早期凋亡水平的影響

為了探究NMN對牛卵母細胞凋亡水平的影響,本研究采用Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒檢測了牛卵母細胞早期凋亡水平。卵母細胞Annexin V-FITC熒光圖像如圖3A-C所示,其中圖3A為未凋亡卵母細胞,圖3B為早期凋亡細胞,圖3C為壞死細胞。如圖3D所示,NMN組卵母細胞凋亡水平顯著低于新鮮對照組(P<0.05),同時,NMN玻璃化組卵母細胞凋亡水平也顯著低于玻璃化對照組(P<0.05),說明IVM期間添加NMN可以有效抑制牛卵母細胞凋亡。

A.正常卵母細胞Annexin V-FITC熒光圖像,標尺=20 μm;B.早期凋亡卵母細胞Annexin V-FITC熒光圖像,標尺=20 μm;C.壞死卵母細胞Annexin V-FITC熒光圖像,標尺=20 μm;D.卵母細胞早期凋亡率

2.4 NMN顯著提高玻璃化牛卵母細胞的發育能力

為了探究NMN對牛卵母細胞冷凍效果的影響,本研究統計了玻璃化牛卵母細胞IVF后的卵裂率和囊胚率。如表1 所示,NMN組的卵裂率((89.57±7.58)%)和囊胚率((45.63±3.78)%)均顯著高于新鮮對照組((80.77±0.70)%,(36.90±1.20)%,P<0.05),且NMN玻璃化組卵母細胞冷凍后的存活率((97.25±0.11)%)、卵裂率((75.47±1.11)%)和囊胚率((33.75±1.43)%)均顯著高于玻璃化對照組((89.29±1.16)%、(52.00±1.26)%、(15.38±1.73)%,P<0.05),表明NMN顯著提高了玻璃化牛卵母細胞的發育能力。

表1 添加NMN對牛卵母細胞玻璃化冷凍后發育能力的影響

3 討 論

脂質含量過高一直被認為是家畜卵母細胞低溫保存失敗的重要原因之一,冷凍前降低脂質含量是提高卵母細胞解凍后發育能力的有效措施之一[25]。卵母細胞中的脂質主要儲存在脂滴中,可被尼羅紅染料特異性結合[35]。因此,本試驗通過尼羅紅熒光探針檢測了NMN對牛卵母細胞脂滴含量的影響。本研究結果表明,IVM期間添加NMN有效降低了牛卵母細胞的脂滴含量。與本研究結果相似,Wang等[52]也發現NMN處理可有效降低小鼠卵母細胞的脂滴含量,且NMN可通過抑制脂質合成、轉運及吸收相關基因的表達,促進脂質氧化相關基因的表達,減少肝臟細胞脂質沉積[48]。以往的研究表明,小檗堿[53]、左旋肉堿[54-55]、共軛亞油酸[56]等物質均可通過降低脂滴含量而改善卵母細胞或胚胎的冷凍效果。本研究表明,NMN可通過減少牛卵母細胞脂滴含量而改善其冷凍效果。

相關研究表明,玻璃化會導致卵母細胞線粒體結構和功能受損,膜電位降低,產生大量的ROS[57]。高濃度的ROS易與脂質結合發生脂質過氧化反應產生過量的脂氫過氧化物,進一步加劇線粒體等細胞器功能損傷,最終導致卵母細胞發育能力下降[58-60]。研究發現,IVM期間添加左旋肉堿不僅降低了豬卵母細胞的脂滴含量,還有效降低了ROS水平[55]。Takahashi等[61]也報道,左旋肉堿可以有效降低牛胚胎脂滴含量且減少2細胞胚胎的ROS含量。Sun等[62]還在大鼠肝臟細胞中發現,小檗堿在減少其脂質沉積的同時抑制了ROS的生成。以上研究表明,降低脂滴含量有助于減少細胞內ROS的產生。因此,本試驗檢測了IVM期間添加NMN對牛卵母細胞ROS水平的影響。本研究結果表明,與對照組相比,NMN有效降低了牛卵母細胞中的ROS水平。與本研究結果相似,Wang等[52]研究也表明,NMN可以促進抗氧化基因SOD1的表達,有效降低衰老小鼠卵母細胞ROS水平[63]。Song等[64]研究還表明,NMN可通過減少氧化應激從而改善豬卵母細胞的發育能力。本研究表明,NMN能有效降低玻璃化牛卵母細胞ROS水平。

研究表明,脂質過度積累造成的氧化應激和內質網應激最終會引起細胞凋亡[65-68]。同時,有研究報道,去脂物質(小檗堿)可以有效減少高脂引起的細胞凋亡損傷[65]。因此,本試驗還檢測了NMN對牛卵母細胞凋亡水平的影響。當細胞發生凋亡時,磷酯酰絲氨酸會從細胞內部翻轉到細胞外部,這種現象被視為細胞早期凋亡標志之一,廣泛應用于卵母細胞早期凋亡水平檢測[69-71]。因此,本試驗檢測了IVM期間添加NMN對玻璃化牛卵母細胞磷酯酰絲氨酸外翻的影響。結果顯示,IVM期間添加NMN有效抑制了玻璃化牛卵母細胞的早期凋亡。與本研究結果相似,Meng等[72]報道NMN可以有效降低細胞凋亡水平,Wan等[73]也報道NMN可以顯著降低促凋亡基因BAX的表達,促進抗凋亡基因BCL2的表達,從而抑制細胞凋亡。本研究結果表明,NMN能有效減少玻璃化引起的卵母細胞凋亡損傷。

此外,本研究結果表明,IVM期間添加NMN不僅可以促進牛卵母細胞的發育,而且可以提高玻璃化牛卵母細胞的發育能力。與本研究結果相似,小鼠和豬上的研究也表明,NMN可通過降低ROS水平、恢復線粒體功能、減少DNA損傷等途徑提高卵母細胞的發育能力[74-75]。

4 結 論

本研究結果表明,IVM期間添加NMN可有效降低牛卵母細胞脂滴含量、ROS水平和凋亡水平,從而改善牛卵母細胞的冷凍效果。本研究結果可為提高家畜卵母細胞耐凍性和促進卵母細胞冷凍技術的應用與推廣奠定一定理論基礎。