不同運動量對灘羊瘤胃菌群多樣性的影響

馬友記,陳鵬飛,馬 青,吳 怡

(1.甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院,蘭州 730070;2.寧夏農林科學院動物科學研究所,銀川 750002)

養(yǎng)羊業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要組成部分,也是廣大農村、牧區(qū)鄉(xiāng)村振興的主導產業(yè)之一[1]。眾所周知,瘤胃是反芻動物特有的消化器官,反芻動物可通過瘤胃中細菌、原蟲和真菌發(fā)酵對飼料進行分解從而獲取營養(yǎng)物質。瘤胃中各種微生物相互作用,能夠影響瘤胃中脂肪、蛋白質等沉積與纖維素的降解速率、改善反芻動物消化功能[2]。此外,瘤胃作為一個厭氧發(fā)酵罐,正常穩(wěn)定的微生物區(qū)系是瘤胃健康發(fā)育的重要保證,而這些微生物在瘤胃結構形態(tài)發(fā)育、免疫功能調節(jié)、抵御外源致病因子侵襲等方面發(fā)揮著重要作用[3-4]。然而,由于反芻動物瘤胃的特殊生理環(huán)境,絕大多數瘤胃微生物很難在體外培養(yǎng),這一特點極大限制了人們對瘤胃生物資源的探索研究。近年來,隨著測序技術的迅速發(fā)展,宏基因組測序已廣泛運用于特定環(huán)境中的微生物組成分析、代謝通路研究以及酶蛋白的功能分析等[5]。

通過調控反芻動物的日糧組成和飼養(yǎng)方式等,可以促進瘤胃內不同微生物群落的定植并產生持久影響[6-8],這也是反芻動物飼料轉化效率不同的原因。姚喜喜等[9]發(fā)現,飼養(yǎng)方式顯著影響了大通牦牛的瘤胃組織結構及瘤胃菌群多樣性和組成。張潔等[10]發(fā)現不同飼養(yǎng)方式因飼喂日糧的不同導致灘羊瘤胃真菌菌群結構發(fā)生了變化。研究表明,運動能夠促進動物腸道菌群改變,如改變菌種豐度和菌群多樣性[11-12]。Kang等[13]研究發(fā)現,運動增加了小鼠腸道內有益菌厚壁菌門和擬桿菌門的豐度。因此,探索不同飼養(yǎng)方式對羊瘤胃微生物群落的種類和豐度的影響,對于制定科學合理的飼養(yǎng)模式是非常必要的。

灘羊作為中國珍貴的裘皮羊品種,適應當地的自然條件,抗逆性突出,耐粗飼,在草質差、產草量低的情況下仍能很好的生長,可見灘羊瘤胃內蘊藏著獨特的木質纖維素降解微生物和酶系。然而,目前關于飼喂方式對家畜的影響多集中在生長性能、消化代謝和肉品質[14-17],對瘤胃微生物菌群的研究比較匱乏。因此,本試驗以灘羊為研究對象,通過高通量測序技術研究不同運動量對灘羊瘤胃菌群多樣性的影響,旨在為健康養(yǎng)殖灘羊提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 時間和地點

試驗于2021年4—8月在寧夏回族自治區(qū)鹽池灘羊養(yǎng)殖基地進行。

1.2 試驗動物與試驗設計

選取同齡、體況良好(體重(20±0.5)kg)的2月齡斷奶灘羊羔羊60只,隨機分為3組(公母各半):即對照組(NC組)、5公里組(5 km組)和10公里組(10 km組),每組20只,每組5個重復,每個重復4只羊,各組分別飼養(yǎng)在同一欄。NC組采取全舍飼飼養(yǎng),5 km組每日沿生態(tài)牧場運動圍欄運動5公里,時間控制在2 h以內;10 km組每日沿生態(tài)牧場運動圍欄運動10公里,時間控制在5 h以內。試驗采用單因素試驗設計,試驗羊佩戴計步器,適度驅趕,實驗人員通過手機端APP,查看運動軌跡和運動量,然后記錄每日運動量,預試期10 d,正試期120 d。

1.3 試驗日糧

參照中華人民共和國肉羊飼養(yǎng)標準NY/T 816—2004配制試驗日糧,試驗日糧及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗期間,每只羊定時定量飼喂。每天早上(6:30)和下午(18:30)喂料2次,期間自由飲水。試驗開始前用2%的NaOH溶液對羊舍進行噴灑消毒,試驗期內每天定時打掃圈舍,保持圈舍清潔、通風,并記錄試驗羊健康狀況。

1.5 樣品采集與處理

試驗結束時,各組隨機選取體重相近、健康狀況一致的7只試驗羊,禁食12 h后屠宰采集瘤胃內容物樣,并在2 h內運送至實驗室,-80 ℃冰箱中儲存用于瘤胃微生物區(qū)系多樣性的測定。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 DNA提取 按照QIAamp DNA Micro kit(德國Qiagen)試劑盒說明書的要求,進行瘤胃內容物宏基因組DNA的分離和純化。DNA樣品先用超微量紫外分光光度(Thermo,美國)測定濃度和純度,后用1%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢測。符合上機建庫要求的DNA樣本送至上海偉寰生物科技有限公司進行測序。

1.6.2 Illumina PE150測序 純化后的樣品利用Illumina PE150高通量測序平臺進行測序。

1.6.3 數據分析 首先對測序數據進行宿主基因的過濾和質量剪切等優(yōu)化處理;其次使用軟件SOAP denovo 2.04對測序數據進行拼接組裝,組裝時選用的kmer參數為65;使用軟件prodigal 2.6.3對基因組序列進行基因預測;最后進行數據庫比對分析。通過BLAST將預測得到的基因序列與GenBank的非冗余核苷酸序列數據庫(Nonredundant database,NR)進行比對(ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy),并獲得物種注釋信息;最后將預測基因與EggNOG數據庫(http:∥eggnog5.embl.de)、GO數據庫(http:∥www.geneontology.prg/)和KEGG數據庫(http:∥www.genome.jp/kegg/pathway.html)進行比對,獲得基因功能注釋。最后使用CAZY數據庫(http:∥www.cazy.org/)的對應工具hmmscan(http:∥hmmer.janelia.org/search/hmmscan)將預測基因與CAZY數據庫進行比對,獲得基因對應的碳水化合物活性酶注釋信息,并使用碳水化合物活性酶對應的基因豐度總合計算該碳水化合物活性酶的豐度。

1.6.4 數據統(tǒng)計與分析 試驗數據以 Excel 2016 軟件進行統(tǒng)計預處理,采用 SPSS 23.0 軟件對所得數據進行正態(tài)分布檢驗,符合正態(tài)分布后進行單因素方差分析(One-way ANOVA),若有顯著差異則采用 LSD 法對組間差異進行多重比較。結果以平均值和標準誤表示,P<0.05表示結果差異顯著,P<0.01表示結果差異極顯著。

2 結 果

2.1 測序結果

本次瘤胃內容物樣本宏基因組測序共獲得1 331 858 536對原始序列數(Raw Reads);雙端Reads質控、拼接后共產生1 324 887 370條高質量序列數(Clean Reads),GC平均含量為52%,說明測序量和測序深度合理,測序結果可信。

2.2 Alpha多樣性分析

從表2可知,5 km組和10 km組的瘤胃微生物Shannon、Simpson和Chao1指數均高于NC組,但三組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 Alpha多樣性指數分析

2.3 Beta多樣性分析

通過主坐標分析(PCoA)發(fā)現,NC組和5 km組瘤胃微生物區(qū)系分布較散亂,沒有規(guī)律性,而10 km組聚類相對較規(guī)律,說明10 km組中瘤胃微生物相似性高(圖1、2)。NMDS分析結果Stress=0.087 4和0.098 3<0.2,表明NMDS分析具有一定的可靠性。相似性分析(ANOSIM)結果顯示,5 km組、10 km組和NC組間R值的范圍為[-1,1],P值為0.394和0.159,說明組間差異大于組內差異,但差異不顯著(P>0.05)。

a.PCoA分析;b.NMDS分析;c.ANOSIM分析

2.4 瘤胃細菌門水平相對豐度

不同運動量條件下灘羊瘤胃細菌蛋白質編碼基因來源主要的菌門有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria),分別占據36.85%、26.32%和22.42%(表3)。試驗組乳酸桿菌門和藍藻門的相對豐度顯著高于NC組(P<0.05)。此外,將不同處理中相對豐度排名前20的物種用柱狀圖和熱圖展示(圖3),發(fā)現在門水平上,10 km組中物種數最多,試驗組和NC組共有物種數是5個,且三組各有1個特有物種。

a.門水平組間物種柱狀圖;b.門水平韋恩圖;c.門水平熱圖。lw1～21為瘤胃樣品編號,其中l(wèi)w2、4、6、8、13、14、16為NC組樣品,lw5、7、10、11、15、17、21為5 km組樣品,lw1、3、9、12、18、19、20為10 km組樣品。下同

2.5 瘤胃細菌屬水平相對豐度

瘤胃微生物屬水平上相對豐度大于0.5%的物種列于表4。屬水平上的普雷沃氏菌屬(Prevotella)、硒單胞菌屬(Selenomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、小桿菌屬(Dialister)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的相對豐度較高,分別占15.63%、8.31%、1.45%、1.84%和2.20%,但組間差異均不顯著(P>0.05)。試驗組的瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度顯著高于NC組(P<0.05)。樣品共有物種分析結果顯示(圖4),在屬水平上5 km組、10 km組和NC組有24個共有微生物菌,10 km組存在3種特有菌且10 km組菌的多樣性依次高于5 km組和NC組,進一步說明運動能夠增加灘羊瘤胃微生物的多樣性。

A.屬水平組間物種柱狀圖;B.屬水平韋恩圖;C.屬水平熱圖

2.6 瘤胃微生物CAZy酶類相對豐度的影響

經hmmscan分析,將基因比對到CAZy數據庫中,結果如表5所示,5 km和10 km組的糖苷水解酶(GHs)、碳水化合物酯酶(CEs)、碳水化合物結合模塊(CBM)和輔助活性酶系(AAs)豐度均增加。5 km組的糖基轉移酶(GTs)相對豐度增加,多聚體裂解酶(PLs)的相對豐度下降;10 km組的多聚體裂解酶(PLs)相對豐度增加,糖基轉移酶(GTs)相對豐度下降。

線性判別分析(LDA)結果顯示,10公里組糖苷水解酶家族中GH43-17和GH34,糖水化合物脂酶類家族中CE-19的功能具有顯著差異;5 km組糖苷水解酶家族中GH102的功能具有顯著差異,差異功能的LDA值分布如圖5A和圖5B所示。

2.7 EggNOG和GO分類結果

對得到的基因進行EggNOG功能分類預測。發(fā)現碳水化合物轉運及代謝顯著富集,并基于比對獲得的COG相對豐度表,篩選出相對豐度Top 30的COG,如圖6所示。

圖6 EggNOG 熱圖

在GO分類中,統(tǒng)計基因在生物過程(biological process,BP)細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個GO類別中。在BP類中,基因多集中在代謝、細胞加工過程;在CC類中,集中在細胞組分的基因居多;在MF類中,集中在結合以及催化功能的基因最多(圖7)。

圖7 前30個GO條目熱圖

2.8 KEGG數據庫的差異功能分析

Level 2層級上相對豐度最高的通路富集分析結果表明,10 km組中主要富集到脂肪酸生物合成,丙酮酸鹽代謝及細菌趨化性等通路;5 km組中主要富集到雙組分系統(tǒng)、碳代謝、輔助因子的代謝、丙酮酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、丙酸代謝、同源重組、脂肪酸生物合成、原核生物中的碳固定途徑、肽聚糖生物合成、鞭毛組裝和脂肪酸代謝通路。

3 討 論

3.1 運動對瘤胃菌群的影響

眾所周知,運動對動物心肺健康、肌肉力量、葡萄糖代謝、免疫系統(tǒng)和心理健康都有積極的影響[18]。前期研究表明運動能夠改善灘羊體內造血功能、促進免疫細胞的激活,有利于增強機體免疫功能[19]。王柏輝[20]研究發(fā)現,放牧組的蘇尼特羊瘤胃和腸道微生物的差異明顯大于舍飼組,特別是普氏菌屬、理研菌屬、擬桿菌屬、丁酸弧菌屬和奎因氏菌屬的含量增高,而舍飼組琥珀酸弧菌屬的含量最多。孫國平[21]發(fā)現,與自然放牧育肥相比,舍飼育肥能明顯提高成熟母羊瘤胃液中的琥珀酸絲狀桿菌和原蟲數量,產甲烷菌數量呈明顯上升趨勢,而對總細菌、瘤胃球菌數量無顯著影響。這些結果證實了運動與微生物種群之間的關聯,揭示了微生物區(qū)系對運動成績、康復和疾病模式的各種指數的影響是通過肌動因子和其他細胞因子發(fā)出信號,調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸,進而影響與運動相關的代謝途徑,但未確定運動量與菌群改變的因果關系。本研究首次探討了灘羊采食后運動5 km和10 km對其瘤胃菌群多樣性的影響。

3.2 不同運動量對灘羊瘤胃菌群Alpha和Beta多樣性的影響

Alpha多樣性指標用于反映特定樣本或單個群落中物種的豐富度和均勻度[22]。Simpson和Chao1反映微生物群落的豐富度[23]。在本試驗中,5 km組和10 km組中兩者的數值較NC組均升高,說明適當的增加運動量會增加瘤胃微生物的豐富度,這與Guo等[13]的研究結果相似。Shannon指數反映微生物群落的均勻度,5 km組和10 km組值高于NC組,說明增加運動量會影響瘤胃微生物群落的均勻度。Beta多樣性分析主要用于比較各樣本中微生物群落整體結構的差異,通過PCoA分析發(fā)現,10 km組菌群坐標值更趨近,而5 km組和NC組顯示較分散,可見每日運動10 km可提高灘羊個體間腸道微生物相似性,表明灘羊每日運動10 km有利于灘羊腸道微生物群落的穩(wěn)定。

3.3 不同運動量對灘羊瘤胃微生物組成的影響

研究表明,反芻動物瘤胃微生物組成復雜多樣,其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在成年反芻動物瘤胃菌群中的門水平上占比最高[24-25]。本試驗共發(fā)現14個門的相對豐度在0.1%以上,其中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門(Proteobacteria)這3個門的相對豐度最高,分別占據36.85%、26.32%和22.42%。擬桿菌門作為第一優(yōu)勢菌門在NC組中的相對豐度為42.43%,數值上高于試驗組中的30.92%和37.2%,這與Jami和Mizrahi[26]在奶牛瘤胃中的研究結果相一致。此外,灘羊瘤胃中的微生物大部分為細菌界,其中瘤胃球菌產生的纖維素酶能降解飼草料中的木質纖維素,被認為是瘤胃中降解木質素的主要微生物,而瘤胃普雷沃菌科能夠大量降解木聚糖及果膠[27-28]。本試驗中5 km和10 km組中瘤胃球菌數顯著高于NC組,在5 km組值最高,隨著運動量的增加瘤胃球菌屬的數量又逐漸降低,說明運動量為5 km時動物機體對木質素的降解效果最好。與NC組相比,5 km和10 km組中的瘤胃普雷沃菌屬的含量有所升高,由此推測,增加運動量能夠促進機體對木聚糖及果糖的降解。之前的研究表明運動可以加大對碳水化合物的利用,為機體提供營養(yǎng)物質[29]。

厚壁菌門是促進動物瘤胃微生物分解纖維素最主要的菌群[30-31],5 km組和10 km組中厚壁菌門的豐度高于NC組,說明運動可提高瘤胃消化纖維素的能力。本試驗發(fā)現,變形菌門的相對豐度在門水平上僅次于擬桿菌門和厚壁菌門,但含量遠低于這兩種門,這與前人的研究一致[32]。Pitta等[33]發(fā)現,變形菌門在瘤胃蛋白質降解、淀粉降解和致病菌的形成中起著重要作用,本試驗中的5 km組和10 km組變形菌門的相對豐度低于NC組,說明運動在一定程度上能抑制致病菌的繁殖。疣微菌門(Verrucomicrobia)是影響哺乳動物免疫功能的重要因素,其豐度的降低與機體免疫功能下降有關[34],10 km組中疣微菌門的相對豐度高于5 km 組和NC組,且NC組的豐度最低,說明運動可增強機體免疫功能。

在屬水平上發(fā)現11個豐度在1%以上的屬,其中以普雷沃菌屬(Prevotella)和硒單胞菌屬(Selenomonas)的相對豐度最高,分別為15.63%和8.31%。雙歧桿菌能在胃腸道建立具有保護力的真菌膜且代謝產物過氧化氫等具有一定的抗菌能力[35-36],能夠有效抵抗病原菌的入侵和定植。本試驗中5 km組和10 km組雙歧桿菌豐度均高于NC組,說明運動可能會增加灘羊瘤胃中的益生菌數量,并抑制有害菌的增殖。Ze等[37]研究發(fā)現,瘤胃球菌屬 (Ruminococcus)在不同飲食結構中的相對豐度存在顯著性差異,并發(fā)現該屬參與瘤胃纖維素和淀粉的降解,本試驗中5 km組和10 km組瘤胃球菌屬相對豐度顯著高于NC組,由此可推測運動能夠通過促進瘤胃球菌屬的繁殖,從而增強機體對纖維素和淀粉的降解能力。樣品共有物種分析結果顯示,10 km組富集到的物種數依次高于5 km組和NC組,該結果表明,運動能夠提高灘羊瘤胃微生物的多樣性。

3.4 不同運動量對灘羊瘤胃微生物功能的影響

碳水化合物的合成與分解是一個復雜的過程[38]。瘤胃微生物菌群是CAZy的重要資源,不但能將纖維素轉化為反芻動物可利用的生物能源,而且在機體碳水化合物代謝、蛋白質糖基化和生態(tài)環(huán)境中都有著重要作用[39-40]。CAZy酶可分為6個功能基團,其中葡萄糖苷酶(GH)、碳水化合物酯酶(CE)和多糖裂解酶(PL)能協(xié)同降解木質纖維素物質[41-42]。糖苷水解酶(GHs)家族中的GH10、GH26和GH28具有半纖維素酶活性,能降解少量的木糖[43],而碳水化合物酯酶(CEs)中的CE8家族的酶具有果膠甲基酯酶活性,可脫去果膠中的甲酯基團,生成果膠酸[44]。試驗組的糖苷水解酶(GHs)、碳水化合物酯酶(CEs)、碳水化合物模塊(CBM)和輔助活性酶系(AAs)豐度均增加,表明增加運動量,改變了機體內碳水化合物酶多樣性。Lynd等[45]研究發(fā)現,碳水化合物結合模塊(CBM)是纖維素酶的重要組成部分,它通過與多糖基體結合增加底物濃度和活力的方式促進酶與纖維素的結合,從而促進纖維素的降解。本試驗結果顯示,5 km和10 km中CBM和輔助模塊酶類數值均高于NC組,表明運動能夠提高灘羊降解纖維素的能力。這與本試驗中瘤胃球菌屬的研究結果類似。在KEGG結果中,5 km 組和10 km組的差異表達基因顯著富集在氨基酸代謝、丙酮酸代謝和脂肪酸生物合成等通路中,說明運動有助于增強CAZy酶的活力,并影響反芻動物瘤胃微生物對碳水化合物的運輸代謝、能量生成和輔酶轉運等過程。

4 結 論

在本試驗條件下,灘羊運動量的增加能夠提高瘤胃微生物的豐富度和多樣性,影響瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)等菌屬的相對豐富度,但對灘羊瘤胃微生物的均勻度沒有顯著影響。