非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定

劉桃雪,蘇冰倩,齊艷麗,郭江濤,劉忠虎,褚貝貝,王 江*,曾 磊*

(1.河南農業大學動物醫學院,鄭州 450046;2.河南農業大學,農業農村部動物生化與營養重點實驗室,鄭州 450046;3.河南農業大學,河南省動物生長發育調控重點實驗室,鄭州 450046)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家豬和各種野豬(如非洲野豬、歐洲野豬等)而引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。其特征是發病過程短,最急性和急性感染死亡率高達100%。非洲豬瘟的爆發,給全球養殖業造成了嚴重經濟損失。雖然對非洲豬瘟已進行了廣泛的研究,但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[1],目前主要是采取早期檢測、嚴守衛生程序、大規模撲殺帶毒家畜和野豬等措施將ASF控制在一定區域[2]。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,是具有雙層膜結構,直徑為200 nm的大型雙鏈DNA病毒,呈復雜的二十面體結構,其結構由內到外依次是內核、內核心殼、內膜、衣殼、囊膜,基因組全長為170～193 kb,中央為保守區,兩側為可變區。ASFV基因組龐大且復雜,并具有雙層囊膜,所以病毒耐受力強變異度高導致難以形成中和抗體[3]。ASFV基因組有150～167個開放閱讀框,編碼150～200種蛋白質,其中至少有54個結構蛋白[4],主要的結構蛋白有p30、p54、p72、pp220、pp62和 CD2v蛋白等[5]。其中,ASFV的p72、p54和 p30等結構蛋白均具有良好的抗原性和免疫原性[6-9],具備血清學診斷價值[10-11]。

p30蛋白是由CP204L基因編碼的重要的內囊膜蛋白,是ASFV的主要結構蛋白之一,也是最具免疫原性的蛋白之一。它能夠介導ASFV對巨噬細胞的吸附和內化,干擾宿主細胞的轉錄與翻譯,在感染后4 h,能在細胞質中檢測到[12],然后在整個感染周期中持續高水平表達,含量豐富且抗原性較高,是重要的病毒早期診斷靶標[13-14]。p30的表達表明病毒已經進入細胞并脫殼,病毒基因的早期表達已經開始[15]。p30蛋白在非洲豬瘟病毒粒子進入宿主細胞中發揮重要作用,抗p30蛋白的抗體對病毒內化有一定的抑制作用[6],這提示p30蛋白參與ASFV的內化過程,但具體作用機制尚不清楚[7,16]。

鑒于p30是早期檢測的優良靶標,本研究通過對ASFV p30蛋白氨基酸序列進行原核密碼子優化,利用大腸桿菌表達系統獲得可溶性重組p30蛋白,將其作為抗原免疫BALB/c小鼠,制備了2株針對p30蛋白的單克隆抗體,均具有良好的特異性,對其抗原表位進行鑒定,并在預測的三級結構中進行標注。為ASFV p30 蛋白結構和功能的研究及血清學診斷試劑的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質粒、菌株 NCBI(MK128 995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株CP204L基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司進行密碼子優化并合成。表達菌株BL21(DE3)感受態細胞購自北京擎科生物科技有限公司、克隆菌株Top10由本實驗室制備及保存。

1.1.2 細胞及毒株 骨髓瘤細胞(SP2/0)購自美國ATCC;豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬圓環病毒(PCV2)、豬細小病毒(PPV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS-CoV)為本實驗室保存。ASFV標準陽性血清購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.3 動物 雌性6～8周齡的BALB/c小鼠購自鄭州大學實驗動物中心。

1.1.4 試劑 考馬斯亮藍R-250購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;弗氏佐劑、HAT、HT貯存液、融合劑PEG1450購自Sigma公司;Ni-NTA Agarose購自QIAGEN公司;AEC酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自Sino Biological公司;Millipore超濾管購自密理博中國有限公司;透析袋購自VAKE公司(USA)。

1.2 方 法

1.2.1 重組質粒構建及鑒定 參考NCBI(MK128 995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株CP204L基因序列,運用在線密碼子優化工具GenSmartTMCodon Optimization根據大腸桿菌的密碼子偏好性調整p30基因的同義密碼子進行密碼子優化CP204L全基因。表達序列兩端引入酶切位點NdeⅠ和HindⅢ及6×His標簽,便于基因克隆和蛋白純化,提交金斯瑞生物科技有限公司合成。將重組質粒命名為pET30a-His-p30。使用限制性內切酶NdeⅠ和HindⅢ對合成的重組質粒pET30a-His-p30進行雙酶切鑒定,酶切鑒定正確后將重組質粒送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.2 重組p30蛋白誘導表達及可溶性分析 將重組質粒轉化至BL21感受態細胞,于37 ℃恒溫振蕩搖床中振蕩培養4 h,至OD600 nm=0.6左右,取1 mL菌液作為未誘導對照,然后分別加入0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1IPTG,于37 ℃及16 ℃,180 r·min-1條件下誘導表達10 h,以確定誘導p30重組蛋白表達的最佳條件。富集菌體,超聲波破碎后,4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min分離上清和沉淀。SDS-PAGE凝膠電泳后經考馬斯亮藍染色檢測蛋白可溶性。

1.2.3 表達蛋白的純化及Western blot鑒定 以最佳誘導條件大量誘導表達p30重組蛋白,參照Ni-NTA Agarose操作技術手冊對破碎后的上清進行純化,通過SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色鑒定蛋白純度。然后經BCA法測定p30蛋白濃度,將其定量為1 mg·mL-1后分裝保存于-80 ℃備用。對純化后的p30蛋白進行Western blot鑒定,使用按1∶1 000比例稀釋的his標簽抗體作為一抗,1∶5 000比例稀釋的HRP標記的兔抗鼠的IgG抗體作為二抗,顯色后,進行免疫印跡結果分析。

1.2.4 動物免疫 取5只6～8周齡雌性BALB/c小鼠(分別記為鼠1～5),將純化的重組p30蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化,通過皮下多點注射方式免疫小鼠,免疫劑量為每只50 μg。二次免疫、三次免疫用弗氏不完全佐劑乳化p30蛋白,每次免疫間隔2周,第3次免疫后1周自小鼠尾部采血,分離血清,用間接ELISA方法測定血清抗體效價;融合前3 d選擇抗體效價最高的小鼠進行再次免疫,每只腹腔注射100 μg重組蛋白。

1.2.5 雜交瘤細胞融合及篩選 再次免疫3 d后將小鼠安樂死,分離脾細胞,在PEG1450作用下將脾細胞與對數生長期的SP2/0細胞按照7∶1的比例進行細胞融合。融合后將細胞鋪至含有HAT選擇培養基的96孔細胞板中培養。細胞融合7 d后,取100 μL培養上清用間接 ELISA 方法進行檢測。陽性雜交瘤細胞需進行2～3次亞克隆,直至抗體陽性率達100%。將穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株擴大培養并凍存于液氮中長期保存。

間接 ELISA方法:將重組p30蛋白用1×PBS稀釋至2 μg·mL-1包被酶標板,4 ℃包被過夜,棄去包被液,100 μL·孔-1PBST,洗滌3次;用5%脫脂奶于37 ℃封閉2 h,PBST洗滌3次;將雜交瘤細胞培養上清作為一抗,加入酶標板,同時設立陰、陽性對照,于37 ℃反應1 h,PBST洗滌3次;加入100 μL HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶2 500稀釋)于37 ℃反應1 h,PBST洗滌3次;每孔加入100 μL TMB顯色液于37 ℃避光顯色15 min;加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應。用酶標儀測定每孔OD450 nm值,待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(S/N)>2.1判定為陽性。

1.2.6 腹水制備及純化 選取12周齡雌性BALB/c小鼠,向小鼠腹腔內注射300 μL弗氏不完全佐劑。7 d后,向小鼠腹腔中注射3×106～4×106個雜交瘤細胞。5～7 d后,小鼠的腹部變大,待觸之有波動感、行動不敏捷、被毛粗糙時收集腹水,于4 000 r·min-1離心5 min,取中間層液體。用飽和硫酸銨沉淀法對所獲得腹水進行純化,收集純化后的目標抗體,標記清楚名稱等信息并分裝后于-80 ℃保存。

1.2.7 單克隆抗體效價測定 利用間接ELISA以純化的p30蛋白為抗原,用PBS稀釋至100 ng·mL-1后加入96孔的ELISA板內,用5%的BSA連續2倍倍比稀釋的待檢抗體作為一抗,用HRP標記的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例進行稀釋作為二抗,TMB顯色15 min后終止,使用酶標儀,讀取各樣品孔OD450 nm值。

1.2.8 單克隆抗體亞型鑒定 包被亞型抗體:用PBS按比例稀釋同型特異性抗體:IgG1(1∶1 000)、IgG2a(1∶2 000)、IgG2b(1∶200)、IgG3(1∶500)、IgM(1∶4 000),之后分別加入96孔微孔板內,每個亞型重復3孔;以單克隆細胞培養上清作為一抗,同時設置陽性對照和陰性對照,用HRP標記的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例進行稀釋作為二抗,TMB顯色15 min后終止,讀取各樣品的OD450 nm值,并判定抗體亞型。

1.2.9 Western blot 反應性鑒定 將pcDNA3-HA及pcDNA3-p30-HA質粒轉染HEK293 T細胞,收取細胞內蛋白進行 Western blot驗證,用HA標簽抗體按1∶1 000比例稀釋作為一抗,用HRP標記的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例進行稀釋作為二抗,加入顯色試劑,顯色后,進行免疫印跡結果分析。

1.2.10 間接免疫熒光試驗(IFA)反應性鑒定 取轉染pcDNA3-p30-HA質粒24 h的HeLa細胞及其玻片(4 mL·L-1多聚甲醛固定),以單克隆細胞培養上清作為一抗,用HRP標記的山羊抗小鼠IgG按照1∶200的比例進行稀釋作為二抗,并對細胞核進行染色,固定玻片后,將玻片置于在熒光顯微鏡下觀察,使用EVOS FL細胞成像系統拍攝照片并保存。

1.2.11 單克隆抗體抗原表位鑒定 利用NetSurfP Ver.1.1 (http:∥gps.biocuckoo.cn/online_full.php)預測p30二級結構,對CP204L基因進行逐步截短(避開α螺旋和β折疊),連接至pGEX4T-3載體,將構建成功的截短質粒轉化至BL21感受態,用IPTG誘導表達后,取1 mL菌液,99 ℃變性10 min,制作蛋白樣品。以純化抗體作為一抗,進行Western blot反應性鑒定,以確定其抗原表位區域。然后使用I-TASSER(https:∥zhanggroup.org/I-TASSER/)在線預測ASFV p30蛋白三級結構,在PyMOL軟件中標注出p30單克隆抗體所識別抗原表位區域。

2 結 果

2.1 密碼子優化

密碼子優化后,與原始序列比對發現堿基序列發生改變(以淺色字體表示,圖1A),編碼的氨基酸類型并未發生改變(圖1B),所表達的p30蛋白的類型也未發生變化。

2.2 重組p30蛋白誘導表達及可溶性分析

為了誘導重組p30蛋白表達及摸索其最適表達條件,將合成的原核表達質粒pET30a-His-p30轉入原核表達菌株BL21(DE3)中,分別采用不同濃度的IPTG和溫度誘導蛋白表達,發現在30 ku處出現目的蛋白,且IPTG濃度為0.4～0.6 mmol·L-1,溫度為16 ℃,10 h誘導效果最佳(圖2A、2B)。SDS-PAGE電泳分析其表達產物有少量以可溶性形式存在于上清中(圖2C)。

A.37 ℃誘導10 h重組蛋白表達情況;B.16 ℃誘導10 h重組蛋白表達情況;C.重組p30蛋白可溶性分析。M.蛋白質相對分子質量;1.pET30a-CP204L未誘導全菌液;2.pET30a-CP204L誘導全菌液;3.pET30a-CP204L誘導上清;4.pET28a-CP204L誘導沉淀

2.3 原核表達蛋白的純化及Western blot鑒定

為了進一步從上清中純化重組蛋白p30,將未誘導全菌液、誘導全菌液、破碎后上清、破碎后沉淀、收集的流穿液、不同咪唑濃度的洗雜緩沖液及洗脫液進行蛋白制樣,SDS-PAGE 檢測樣品中蛋白純化效果,結果發現,在100和250 mmol·L-1咪唑洗脫液樣品中存在洗脫的目的蛋白p30,大小為30 ku,且條帶單一(圖3A)。為了驗證純化后的目的蛋白,對表達產物進行Western blot驗證,一抗為鼠源的His標簽抗體,二抗為HRP標記的山羊抗鼠的IgG抗體,結果顯示目的蛋白可與His標簽一抗結合良好,條帶與預期大小30 ku一致(圖3B),說明蛋白成功表達。

2.4 單克隆抗體 Western blot 及IFA反應性鑒定

為了鑒定獲得的2株ASFV p30蛋白的單抗與真核表達p30蛋白是否具有良好的結合活性,將pcDNA3-HA及pcDNA3-p30-HA質粒轉染HEK293 T細胞,收取細胞內蛋白進行 Western blot驗證,一抗為anti-HA和2G10-2、6D2-1,二抗為HRP標記的山羊抗鼠的IgG抗體,結果顯示目的蛋白pcDNA3-p30-HA成功表達,獲得的2株p30單克隆抗體均能與p30蛋白發生特異性反應,蛋白質大小約為30 ku(圖4A)。其次,IFA結果顯示,2株單克隆抗體均與細胞內ASFV p30瞬時表達產物結合良好,在顯微鏡下可見綠色熒光,定位于細胞質中,空載體轉染孔對照無熒光呈現(圖4B)。

A.Western blot鑒定p30單克隆抗體的特異性;B.IFA鑒定p30單克隆抗體的特異性

表明獲得的2株ASFV p30蛋白的單抗與真核表達p30蛋白均具有良好的特異性。

2.5 單克隆抗體抗原表位鑒定

ASFV p30蛋白二級結構由無規卷曲、α螺旋、β折疊構成(圖5A),對p30肽段進行截短,保證每段α螺旋、β折疊的完整,進一步Western blot分析,結果表明ASFV-P30識別的氨基酸序列范圍是C端170～194 aa共25個氨基酸,氨基酸序列為:IYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKK(圖5B)。在p30蛋白三級結構可視化的基礎上,標注出p30單克隆抗體識別抗原表位區域170～194 aa(圖5C,以紅色區域表示)。

A.ASFV p30蛋白二級結構預測結果;B.ASFV p30蛋白截短示意圖及抗原表位鑒定(M.蛋白分子量 Marker;1.pGEX4T-p30;2.pGEX4T-p30-Δ1;3.pGEX4T-p30-Δ2;4.pGEX4T-p30-Δ3;5.pGEX4T-p30-Δ4;6.pGEX4T-p30-Δ5;7.pGEX4T-p30-Δ6);C.ASFV p30蛋白的三級結構

3 討 論

非洲豬瘟病毒作為非洲豬瘟病毒科唯一成員,堿基數多達17萬～19萬個,基因組龐大,能夠編碼多種蛋白質,包括結構蛋白和免疫調節蛋白,其結構和免疫逃逸機制復雜,能夠逃避宿主免疫細胞的清除,但其與宿主細胞的互作機制尚不清晰。針對非洲豬瘟的各種疫苗策略已經進行了研究,早期側重于以抗原為基礎的方法,旨在誘導中和血清學反應,以CD2v為抗原不能引起機體足夠的免疫保護,此后,許多亞單位疫苗的方法都集中在p54和p30,數據結果顯示p54和p30同時免疫機體可延緩ASFV臨床癥狀,因此深入對ASFV蛋白質組和單個蛋白質功能的研究,對合理設計靶向疫苗方法具有重要意義[17-19]。

現階段對非洲豬瘟的控制主要依靠傳統的措施:動物一旦確診感染,立刻采取全撲殺以防范ASFV的進一步擴散和蔓延。因此,快速準確的診斷識別ASF是該病流行病學管理的關鍵。目前主要將p72、p54、p30蛋白作為診斷抗原用于ASFV感染時的血清學診斷。有研究表明,與p54蛋白相比,可能由于p30擁有構象表位,在ELISA上的靈敏度更高[20]。且p30蛋白在ASFV感染后2～4 h即可表達,能誘導中和抗體的產生,在整個感染期都能檢測到,更適用于早期診斷。因此本研究通過原核表達系統,獲得了純度較高的可溶性p30蛋白,建立了獲得可溶性p30蛋白的體系,且蛋白純度高,經鑒定具有良好的反應原性,可用于間接ELISA來檢測ASFV的感染。進一步利用p30蛋白免疫小鼠,制備了高特異性的p30單克隆抗體,可應用于阻斷ELISA方法的建立,這為血清學檢測方法的進一步發展提供了材料。

研究病毒蛋白的特性及評估p30蛋白的抗原表位特征,尤其是保守表位特征,有助于研究人員更好理解病毒的生物特性和宿主的免疫反應機制,還能為發展和改進ASF診斷和監測的血清學檢測方法以及疫苗的研發提供重要信息[21-22]。Petrovan等[23]的研究初步鑒定了p30的61～93位氨基酸之間的表位,該區域也被ASFV感染豬的血清識別,提示該區域是具有重要免疫功能的表位[24]。同時也鑒定了p30蛋白C端部分中的一個大多肽片段(120～204 aa)與高度柔性和潛在無序傾向區域(91～143 aa)部分重疊可能是 p30 蛋白的抗原表位區域,該結果與本研究的試驗結果相似。本研究進一步縮小了p30蛋白的抗原表位分布范圍。目前已有研究報道ASFV病毒顆粒[25]、p54蛋白[26]和p72[8]蛋白的結構解析,但是沒有關于p30蛋白結構解析的報道,故本研究通過I-TASSER軟件在線預測ASFV p30蛋白三級結構,并標注出p30單克隆抗體識別的抗原表位區域,為ASFV p30蛋白結構的研究奠定了基礎。

4 結 論

本研究制備了2株非洲豬瘟病毒China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株p30蛋白的單克隆抗體,同時利用蛋白截短表達的方式鑒定了170I～K194是其識別的抗原表位區域,進一步通過I-TASSER軟件在線預測ASFV p30蛋白三級結構,并標注出p30單克隆抗體識別的抗原表位區域,豐富了p30蛋白的抗原表位信息,為ASFV p30蛋白結構的研究及血清學檢測方法的進一步發展奠定了基礎。