羊腹瀉樣本中大腸桿菌的分離、毒力基因與耐藥性分析

劉鑫歡,惲佳蕾,毛 立,李基棕,郝 飛,何苗鋒,,楊蕾蕾,張紋紋,程子龍,孫 敏,劉茂軍,,3,5,王少輝,白 娟,李文良,,3,,5*

(1.南京農業大學動物醫學院,南京 210095;2.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業農村部獸用生物制品工程技術重點實驗室,南京 210014;3.江蘇大學食品與生物工程學院,鎮江 212013;4.中國農業科學院上海獸醫研究所,上海 200241;5.獸用生物制品(泰州)國泰技術創新中心,泰州 225300)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)為革蘭陰性菌,呈短桿狀,主要引起動物和人發生胃腸道感染,導致腹瀉,有的菌株還會導致尿路或局部組織感染[1]。腸道致病性大腸桿菌對養殖業危害最為普遍,主要包括產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigencE.coli,ETEC)、產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingE.coli,STEC)、腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli,EPEC)和腸侵襲性大腸桿菌(enteroinasiveE.coli,EIEC)等[1]。羊感染腸道致病性大腸桿菌后主要出現腹瀉、消瘦等癥狀,嚴重者出現敗血癥、休克死亡[2]。此外,牛羊等反芻動物是STEC的攜帶者,STEC對人畜都具有較強的感染能力,傳播途徑廣泛,經由養殖-加工產業鏈傳播的風險很高,造成巨大的公共衛生威脅[1,3]。除了O157:H7 型,研究者也越來越重視非 O157 型STEC的監測[4-7]。

近十余年來,華東地區養羊業快速發展,形成以自繁自養和異地育肥模式為主的規模化肉羊養殖產業。但伴隨著規模化集約化養殖,羊病呈多發且普遍流行趨勢,由大腸桿菌引起的疾病較為常見[8]。同時,獸醫臨床上抗菌藥的不規范不合理使用造成大腸桿菌耐藥性日益嚴重。在不同類型抗菌藥物持續作用壓力下,耐藥質粒在菌株間發生結合與傳遞,導致多重耐藥性(multi-drug resistance,MDR)[9]。耐藥性的日益增強以及MDR菌株的出現對大腸桿菌病的防治及公共衛生安全帶來極大的威脅[10]。現有研究報道表明部分省區羊源大腸桿菌的檢出率和耐藥性都普遍較高[11-13]。但與豬禽等來源的大腸桿菌相較,羊源大腸桿菌流行菌株特性的研究報道仍相對較少,且毒力基因、耐藥性等特性存在地區差異,尤其對華東地區羊源大腸桿菌的相關報道十分缺乏。因此本研究對華東地區四個省份規模化羊場腹瀉源大腸桿菌感染情況進行調查研究,并對分離菌株進化分群、毒力基因、耐藥性進行檢測分析,為深入開展流行病學、病原學研究和該病的防治提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品

樣品于2015—2021年采集自華東地區四省(江蘇、安徽、浙江、江西)發生腹瀉的肉羊養殖場病死羊腸道組織或糞便拭子(共計187份),采集后冷藏保存,24 h內用于細菌分離。

1.2 試 劑

通用型柱式基因提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;2×Rapid Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA 分子量標準DL2000購自北京全式金生物科技有限公司;麥康凱培養基、伊紅美藍培養基、革蘭氏染液購自青島海博生物試劑有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離鑒定

將新鮮糞便拭子置于1.5 mL離心管中,加入1 mL無菌PBS浸泡稀釋30 min。在無菌環境中吸取浸泡管中PBS 100 μL于麥康凱培養基上涂布均勻。腸道組織樣品表面滅菌處理后,在無菌環境中剪開,接種環刮取腸黏膜,劃線接種于麥康凱培養基。接種后的培養板置37 ℃培養箱培養16～18 h后挑取淡粉色光滑菌落,于伊紅美藍培養基上劃線分離純化。37 ℃恒溫度培養16～18 h后,選擇培養皿上符合大腸桿菌菌落生長特點(黑色、金屬光澤)的單菌落挑取,接種于LB培養基中37 ℃中振蕩培養16～18 h。對分離菌株進行革蘭染色鏡檢;同時使用16 S rRNA引物[14],進行菌液PCR擴增。PCR反應體系為20 μL:模板(新鮮培養的菌液)2 μL,2×Mix 10 μL,上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1,引物由北京擎科生物科技有限公司合成),ddH2O 6 μL。PCR反應條件:95 ℃ 預變性3 min;95 ℃變性15 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統觀察后,切取符合目的片段大小的PCR產物,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序并對測序結果進行BLAST對比分析。每份樣品挑取的2個單菌落進行測序鑒定,結果完全相同的判定為同一株菌,有差異的判為兩株菌。每株菌均分裝凍存于-40 ℃。

1.4 大腸桿菌系統進化群鑒定

按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取大腸桿菌分離株DNA。以提取的DNA為模板,根據參考文獻[15]使用chuA、yjaA、TspE4.C2的3對系統進化分群基因引物(引物由北京擎科生物科技有限公司合成)按照“1.3”的反應體系和反應程序進行擴增,并依據檢測結果按照文獻[15]中的判定標準對大腸桿菌菌株進行分群。

1.5 大腸桿菌毒力基因鑒定

按照參考文獻[16-20]合成檢測大腸桿菌毒力基因的引物,對大腸桿菌分離株所攜帶的papC、tsh、mat、ibeB、yijp、vat、iss、cvaC、ompA、neuA、chuA、fyuA、irp2、iroN、afa、draB、hlyA、stxl、stx2、eae、LT、Sta、STb、fimC、aatA、iucD、crlA、iha、cnf1/2、F17b及F17c等31種毒力基因進行檢測,按照“1.3”的反應體系和反應程序進行PCR擴增,根據不同引物對的Tm值調整退火溫度。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。根據結果分析各毒力基因檢出率及其與進化群的分布關系。

1.6 大腸桿菌藥敏試驗

選取青霉素類(氨芐西林、阿莫西林)、頭孢菌素類(頭孢呋辛、頭孢曲松)、碳青霉烯類(亞胺培南、美羅培南)、氨基糖苷類(鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素)、磺胺類(復方新諾明)、四環素類(多西環素)、氟喹諾酮類(諾氟沙星、恩諾沙星)、多肽類(多黏菌素B)共8大類16種抗菌藥,采用圓盤擴散試驗(K-B法)鑒定大腸桿菌分離株的抗菌藥敏感性。根據藥敏紙片使用說明書和CLSI的標準和建議,分別以R(耐藥)、I(中介)、S(敏感)對其耐藥性進行評價。分析每種藥物和每類藥物的耐藥比例并統計多重耐藥菌株分布情況。

2 結 果

2.1 細菌分離鑒定

經過分離、純化和測序鑒定,共計從187份臨床樣品中分離到163株大腸桿菌,分離率為87.17%。分離所得大腸桿菌菌株在麥康凱培養基上生長形態為粉紅色光滑的圓形菌落,在伊紅美藍培養基上生長形態為黑色并有金屬光澤菌落。經革蘭染色后,顯微鏡下觀察菌落形態為兩端鈍圓革蘭陰性桿菌。測序結果通過NCBI進行Blast對比分析,與大腸桿菌16 S rRNA基因序列相似性達到99%～100%。

2.2 系統進化群鑒定

根據PCR擴增結果分析,分離的163株大腸桿菌中,屬于系統進化群B1群的菌株最多(n=97),占比59.51%。其次為A群,檢出率為28.83%,D群的檢出率為9.82%,B2群的檢出率最低,為1.84%(圖1)。

圖1 大腸桿菌分離株系統進化分群分布情況

2.3 毒力基因檢測分析

對分離到的163株大腸桿菌進行31種毒力基因的檢測。結果如圖2所示,yijp、crlA、mat、ompA、fimC、ibeB6種毒力基因的檢出率均>80%,分別為99.39%、98.77%、95.71%、91.41%、87.73%、87.73%。其次,eae、stx2、iucD、iss、fyuA、irp2、iroN、ibeA、aatA的檢出率分別為57.67%、42.33%、41.10%、33.13%、31.29%、26.38%、20.86%、14.11%、12.27%。chuA、cva/cvi、hlyA、neuC、F17c、papC、Sta、stx1、vat、F17b、tsh、iha、cnf1/2、STb這14種毒力基因的檢出率在10%以下。所有菌株中均未檢出afa/draB和LT毒力基因。163株大腸桿菌平均毒力基因數量為8.93。stx1和stx2這兩個毒力基因是STEC鑒定的重要靶點,存在stx1或stx2毒力基因的菌株定義為STEC菌株。本試驗163株分離菌株中,有72株菌屬于STEC。72株STEC中編碼毒力基因同時含有stx1和stx2的菌株有1株,只含stx1或stx2 的菌株數分別3株和68株;其中B1群有52株,A群中有15株,D群與B2群中分別有4株和1株;B1群菌株占72.22%,為優勢群(圖3)。STEC另一標志性毒力基因eae在72株STEC中檢出率為61.11%(44/72)。

圖2 大腸桿菌毒力基因總檢出率(總菌株數,n=163)

2.4 大腸桿菌毒力基因與系統進化群間相關性

毒力基因在各進化群分布熱圖顯示(圖4),fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA基因在腹瀉源大腸桿菌各群間均廣泛分布。eae、fyuA、iucD、stx2、irp2和aatA在各群中也均有分布,但檢出率較低。此外,fyuA在B2群和D群中占優勢,iucD在A群和D群占優勢,aatA和F17b在B2群中占優勢,iss和stx2在B1群居多。B1群中菌株平均攜帶8.82個毒力基因,略低于總體平均水平;A群和D群菌株平均攜帶9.29和9.69個毒力基因;B2群菌株平均毒力基因個數最多,為10.33個。

2.5 大腸桿菌耐藥性檢測

163株大腸桿菌分離菌株對受試藥物表現出高度耐藥(圖5)。16種受試抗菌藥中有4種的耐藥率大于80%,包括多西環素(89.57%)、氨芐西林(86.50%)、恩諾沙星(85.28%)、復方新諾明(81.60%)。分離菌株對四環素類、青霉素類、磺胺類耐藥率均大于80%;對氟喹諾酮類藥物耐藥率為74.85%～85.28%;對氨基糖苷類藥物耐藥率為45.40%～72.39%;對頭孢菌素類藥物耐藥率為57.67%～66.87%;對多肽類(多黏菌素B)耐藥率相對較低,為57.06%。此外,在本次藥敏試驗中發現分離菌株對碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南也表現出耐藥,耐藥率分別為11.04%和10.43%。

除較高的耐藥性檢出率,分離的大腸桿菌中對10種及以上藥物耐藥的占67.48%(110/163)。在163株菌株中92.02%菌株對3～8類抗菌藥耐藥,屬于MDR菌株。大部分菌株表現為五重及以上耐藥(84.05%,137/163);七重耐藥菌株最多,達34.36%,其次為六重耐藥菌,占29.45%;本次分離菌株中對所有八類藥物都耐藥的菌株數為12株,占7.36%(圖6)。

3 討 論

大腸桿菌作為引發人畜腹瀉性疾病的重要病原,對養殖業健康發展和公共衛生安全造成巨大威脅。隨著我國規模化養羊業的快速發展,大腸桿菌引發的疾病在臨床越來越普遍且造成了較大的經濟損失。為了解當地羊群大腸桿菌的感染情況,國內部分學者對當地羊源大腸桿菌開展流行病學調查。但由于各地環境氣候及養殖模式的差異,大腸桿菌的流行情況也存在差異。西藏那曲市(28.3%)和甘肅省(38.89%)羊源大腸桿菌總體分離率相對較低[2,21]。而寧夏回族自治區(91.0%)、青海高原牧區(88.9%)和陜西省(92.59%)的分離率普遍較高[11,22]。宋曉莉等[13]對江蘇地區羊源大腸桿菌進行檢測,總分離率為74.67%(56/75)。本試驗對華東地區4個省份腹瀉羊源大腸桿菌檢測,總分離率為87.17%,與上述寧夏、青海、陜西地區的分離率接近,這說明大腸桿菌在本地區羊場腹瀉疾病中扮演重要角色。上述報道均未對分離菌株進行進化分群分析,本研究對163株分離株進行進化群分析發現B1群最多,B1和A群共占88.34%(144/163),這與國內外研究報道對羊源大腸桿菌分離株進行鑒定,B1為優勢群的結論一致[23-25],也與豬源、牛源大腸桿菌的優勢進化群為A群或B1群的報道一致[26-28]。

大腸桿菌的致病性與其攜帶毒力基因種類和數量密切相關。本研究對分離的163株大腸桿菌進行31種毒力基因的檢測,除afa/draB和LT,其余毒力基因均有檢出,平均毒力基因數量為8.93個。fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA這6個黏附、侵襲相關的毒力基因檢出率均大于80%,且在各進化群菌株中均廣泛分布。研究表明yijp和ibeB基因在大腸桿菌引發腦膜炎的發病機制中也發揮重要作用[29]。irp2是參與耶爾森強毒力島(high pathogenicity island,HPI)合成的主要毒力基因之一,與fyuA共同調節大腸桿菌的致病性[30]。本研究中這兩個毒力基因檢出率分別為31.29%和26.38%。根據毒力基因檢測結果,在本次分離的大腸桿菌中發現72株STEC(44.17%)。這與新疆(42.86%)、寧夏地區(53.7%)羊源STEC檢出率相似[31-32]。相關報道對羊源STEC研究中stx1檢出率均高于stx2[4,23,33]。然而在本研究中,72株羊源STEC菌株stx2的檢出率為42.33%,明顯高于stx1(2.45%)。此外,由eae基因編碼的緊密黏附素在STEC發病機制中起著關鍵作用[5]。本研究中STEC中的eae毒力基因的檢出率為61.11%,遠遠高于國內外報道的檢出率[4,6,23,33]。這可能與樣品來源和種類不同有關(本研究菌株均分離自發生嚴重腹瀉病死羊腸道或糞便),需要更進一步研究證實。上述毒力基因及STEC菌株的高檢出率提示應重視羊源大腸桿菌的監測及其對公共衛生的威脅。

細菌耐藥性一直是威脅健康養殖和公共衛生安全的巨大問題。隨著肉羊規模化養殖的發展,抗菌藥物的使用也越來越普遍[25]。本研究中,163株大腸桿菌對16種受試抗菌藥平均耐藥率為63.54%,有13種藥物的耐藥率大于50%,4種大于80%。復方新諾明和多西環素的耐藥率與楊躍飛等[34]對江蘇及周邊地區送檢的病(死)動物病料中分離到的大腸桿菌耐藥比例以及宋曉莉等[13]對羊源大腸桿菌的檢測結果相近。分離菌株對治療MDR菌感染的“最后一道防線”——多黏菌素B的耐藥率也達57.06%;對碳青霉烯類藥物的耐藥率范圍為10.43%～11.04%,都顯著高于先前的同類報道[11,25,31-32]。這對公共衛生安全帶來了嚴峻的挑戰。近些年來,細菌多重耐藥的情況也越來越嚴重。趙學亮等[11]檢測陜西省部分地區腹瀉羊源致病性大腸桿菌中98%為MDR菌株。馮杰等[32]檢測寧夏羊源大腸桿菌耐藥性發現27.59%(16/58)的分離株為MDR菌株。惲佳蕾等[8]檢測了49株分離自病羊肺的大腸桿菌,均為MDR菌株。本研究發現92.02%的菌株屬于MDR菌株,大部分菌株表現為五重及以上耐藥(84.05%,137/163),有12株菌對所檢測的8類藥物均耐藥。這表明華東地區羊源大腸桿菌耐藥性普遍且嚴重,加強對肉羊養殖環節大腸桿菌耐藥性的研究和科學用藥指導十分重要和迫切。

4 結 論

隨著規模化養羊的快速發展,頻繁地調運、薄弱的生物安全措施和不科學的用藥技術加劇了大腸桿菌及相關疾病的傳播和危害性。本研究表明大腸桿菌在江蘇、安徽、浙江、江西發生腹瀉羊群中具有很高的流行率,分離菌株毒力基因種類多樣、耐藥性強,多重耐藥菌株和STEC占比較高。有必要對羊源致病性大腸桿菌的流行情況進行持續的調查研究,為深入開展流行病學、病原學研究和羊場大腸桿菌病的防治提供基礎和參考。