生產母兔沙門菌感染的病理學變化及其藥物敏感性分析

張倩文,劉玉梅,石麗輝,梁文軍,李夢云,王玉琴,張自強*

(1.河南科技大學動物科技學院,洛陽 471000;2.南陽中農高盛生物工程有限公司,南陽 473300)

兔沙門菌病是由沙門桿菌引起的一種細菌性傳染病。臨床上多表現為出血性敗血癥,也可引起發病動物出現腹瀉及孕母畜流產等癥狀[1-2]。有研究發現,生產母兔沙門菌感染率為30.30%～73.33%[3],敗血癥和流產是導致母兔死亡的主要原因[4]。患病兔有內臟器官充血或有出血斑,子宮粗大,黏膜表面有膿性分泌物的特點[5],各器官容易發生不可逆病變而加重細菌感染。沙門菌屬于機體正常寄居菌,當某種因素打破體內細菌的生存平衡時或者環境中出現大量致病菌時,會誘使細菌大量生長和繁殖,使動物出現炎癥,引發疾病,從而產生較高的死亡率[6-9]。

妊娠母兔免疫系統較弱,自身恢復能力有限,易受外界環境影響,妊娠期間母兔營養水平要求較高,同時,也易感染傳染性疾病,如大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、病毒性出血癥病毒等,造成流產和死亡[10-11],但均未有進一步的組織學病理研究,而對母兔感染沙門菌的組織病理學變化更是鮮有報道。本研究在宏觀和微觀角度觀察沙門菌感染孕母兔引起的病理學特征,并通過藥物敏感性試驗確定沙門菌對16種常用抗生素的耐藥譜,對該致病菌感染的防治、科學用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 患病動物臨床癥狀及主要試劑儀器

患病來自河南某規模化種兔場,為妊娠天數為25～30日的經產母兔,患病兔死亡前每次主要疫病(兔病毒性出血癥、兔球蟲、兔大腸桿菌、兔多殺性巴氏桿菌等)的例檢均為陰性。該兔場妊娠母兔發病率為40%,死亡率為50%。患病母兔出現精神沉郁、呼吸短促、呼吸聲音重、便血、發熱、腹瀉嚴重、難產、食欲下降、流產、陰門紅腫等臨床癥狀。

麥康凱瓊脂培養基購自海博生物技術有限公司、藥敏紙片購自溫州康泰生物科技有限公司。多聚甲醛購自天津市豐華化學試劑廠。沙門菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司。細菌基因組DNA小量提取試劑盒、DL2000 DNA Marker購自南京諾唯贊科技有限公司。主要儀器包括攤片機(KD-P),烘片機(KD-H),微波爐(P70D20TL-P4),PCR儀(Applied Biosystems)等。

1.2 患病動物剖檢及樣品采集

剖檢患病母兔6只,健康母兔3只,觀察母兔的病變情況。按照常規剖檢程序對患病和健康母兔進行無菌剖檢,觀察病兔組織器官剖檢變化,分別取心、肝、脾、肺、腎、子宮組織于培養基中進行培養,并取取心、肝、脾、肺、腎組織于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 病原菌的分離、血清型鑒定與分子生物學鑒定

無菌條件下取病兔心、肝、脾、肺、腎、子宮等組織,接種于普通瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基,置于培養箱中培養。挑取單菌落涂片染色,鏡檢并純化。勾取純化后的菌落進行血清型鑒定,通過觀察菌體涂片在生理鹽水中是否有凝集現象排除菌體的自凝性,后進行菌體抗原 O的血清凝集性試驗,確定沙門菌的血清型。取純化后的菌落按照細菌基因組提取試劑盒說明書的步驟進行抽提,將其作為PCR擴增模板,參照亓玉卓等[12]的PCR方法擴增,所得PCR產物進行凝膠電泳并測序鑒定,引物序列見表1。

1.4 病兔組織病理學觀察

取病兔心、肝、脾、肺、腎組織固定于4%多聚甲醛中。組織經 70%、80%、90%、95%、100%無水乙醇中逐級脫水。之后進行組織塊透明和石蠟包埋,將包埋好的組織塊切成 5 μm 切片并烘干。室溫下,將切片進行蘇木精-伊紅染色,染色后的切片使用不同濃度無水乙醇脫水,切片透明并封片。使用顯微鏡采集照片。

1.5 動物致病性試驗

取分離菌株培養液(濃度為109CFU·mL-1)對小鼠進行致病性試驗,驗證分離菌株的致病性。取8只KM小鼠(20 g左右,SPF級)隨機分為2組,每組4只,第一組小鼠每只腹腔注射0.2 mL菌液(沙門菌處理組),第二組小鼠每只注射0.2 mL生理鹽水(對照組)。相同環境下飼養,記錄發病情況,對病死小鼠剖檢。

1.6 病原菌藥物敏感性分析

使用κ-B法(紙片擴散法)對分離菌進行抗生素藥物敏感性檢測,抗生素紙片包括氟苯尼考、丁胺卡那、頭孢哌酮、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、復方新諾明、氧氟沙星、慶大霉素、頭孢氨芐、氨芐西林、恩諾沙星、環丙沙星、四環素、多黏菌素B。

2 結 果

2.1 患病兔剖檢狀況觀察

剖檢病兔各組織器官均出現明顯癥狀。共剖檢發病母兔6只,剖檢發現致病菌感染懷孕母兔后,多數器官出血,并伴有一定程度的壞死,但不同器官組織的病理損傷程度不同。剖檢結果顯示,患病兔心包黏連,嚴重者見心包和心難以分離;肺見淤血、嚴重出血、肺表面有纖維素性滲出,形成灰白色結節;肝變性,有灰黃色壞死小點或灰白色結節;脾呈暗紅色;腸道黏膜呈卡他性炎癥;病兔子宮內有木乃伊胎,子宮腫脹,有膿性滲出物,子宮壁增厚,黏膜上有大量出血點。

2.2 病原菌分離、血清分型及PCR鑒定

在6只發病母兔的心、肝、脾、肺、腎和子宮處均分離得到致病菌。分離菌在普通培養基上形成灰白色、中等大菌落(圖1A),在麥康凱平板上培養形成無色透明或半透明圓形小菌落(圖1B)。革蘭染色結果顯示,分離菌在鏡下呈粉紅色、卵圓形(圖1C)。之后進行血清學分型O抗原鑒定,結果顯示,分離菌株均出現凝集現象,初步表明分離菌是沙門菌。以純化病原菌提取的細菌DNA為模板,進行PCR反應,發病兔分離純化得到的細菌均在1 494 bp處出現條帶(圖2)。將擴增產物進行測序,序列經NCBI(Blast)數據庫進行比對分析,與沙門菌序列相似度較高。同時構建遺傳進化樹(圖3),結果顯示,從6只發病母兔各器官中分離得到的病原菌與登錄號為CP054898.1的沙門菌同源性為99.71%。表明患病母兔感染的是沙門菌。

A.普通固體培養基沙門菌的菌落形態;B.麥康凱固體培養基沙門菌的菌落形態;C.沙門菌革蘭染色

圖3 沙門菌16S rRNA基因系統發育樹

2.3 動物致病性試驗

用分離純化病原菌對小鼠進行致病性試驗,結果顯示,第1組沙門菌處理小鼠在24 h內全部死亡,第2組小鼠正常(對照組)。剖檢病死小鼠發現,沙門菌處理組小鼠肝組織邊緣發黑,表面有纖維素性壞死物,腫大;肺布滿出血斑;脾淤血、腫大;胃、腸黏膜透明,胃內容物發黃,腸內容物發綠。取死亡小鼠肺、肝、脾、腸組織接種普通固體培養基,分離的菌落特征和染色鏡檢結果均與原分離菌株一致,經分子生物學鑒定發現鼠分離株與原菌株相同。結果表明,沙門菌對動物具有致病性和致死性。

2.4 組織病理學變化觀察

制作沙門菌感染母兔和健康母兔組織器官的石蠟病理切片,進行組織病理學觀察。結果顯示,病兔心肌纖維彎曲、排列紊亂,有斷裂,間質水腫,紅細胞浸潤,肌漿中出現蛋白質顆粒或空泡(圖4A、B);肝細胞顆粒變性、脂肪變性,成大量空泡狀,竇狀隙變窄,部分區域淤血,在小葉內顯示局部壞死,有少數淋巴細胞及異嗜性細胞浸潤,膽管周圍的毛細血管嚴重充血(圖4C、D)。脾組織出現明顯淤血、出血,白髓中淋巴細胞明顯增多,網狀細胞增生,可見壞死灶;紅髓中充滿巨噬細胞,還有較多含鐵細胞,竇內皮細胞增生,充滿大量紅細胞,紅白髓界限不清(圖4E、F)。病兔肺組織廣泛淤血,肺泡壁結構幾乎消失,細支氣管上皮細胞變性、壞死、脫落,管腔中有中性粒細胞和脫落的上皮細胞(圖4G、H)。病兔腎小球充血、腫脹;毛細血管擴張充血;腎小管上皮細胞顆粒變性、水泡變性(圖4I、J)。

結果表明,沙門菌感染使得母兔器官發生明顯組織病理學變化,以各器官組織紅細胞浸潤,血管充血,細胞顆粒或脂肪變性為主要病理學特征。

2.5 分離菌藥物敏感性

藥物敏感性試驗結果表明,沙門菌對頭孢哌酮、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、復方新諾明、氧氟沙星、慶大霉素、頭孢氨芐、氨芐西林、恩諾沙星、環丙沙星、多黏菌素B1、四環素共15種藥物表現出敏感性,對丁氨卡那未出現敏感性。表明沙門菌分離株對大部分革蘭陽性菌和陰性菌的抗生素和廣譜抗生素均敏感,對丁胺卡那耐藥可能與其在兔場頻繁使用有關。

3 討 論

動物受到外界條件變化影響,抵抗能力下降,抗沙門菌能力減弱時,容易引發沙門菌病[13-15]。劉照波等[16]研究發現,發病兔通過糞口或垂直傳播,引起兔群發生沙門菌病,且傳播速度較快,病死率較高,并且伴有腹瀉癥狀。李欣[17]以發熱、腹瀉、妊娠母兔流產、死亡為特征的病兔為研究對象,發現沙門菌是造成妊娠母兔死亡的主要原因。本研究中,從流產病兔心、肝、脾、肺、腎、子宮處分離得到疑似病原菌,經過細菌形態和特種培養基鑒定,結合臨床癥狀及病理變化特點,初步判斷為為沙門菌。后經血清分型、PCR鑒定及沙門菌同源性分析,確定引起妊娠母兔出現流產癥狀的的病原菌為沙門菌。

表2 分離菌藥物敏感性試驗結果統計表

本研究觀察發現,與健康母兔相比,沙門菌感染母兔后,機體器官系統發生出血病變,以肺和肝的病變最為顯著。當沙門菌感染機體時,不僅會導致生殖系統異常、功能障礙,還會造成全身器官系統的結構損傷、機能異常[18-20]。譚爍等[21]研究發現,小鼠感染腸炎沙門菌后,主要組織器官出現腫大、壞死、細胞空泡變性、炎性細胞浸潤。劉俊偉等[22]研究發現,感染沙門菌豬的各內臟器官表現為敗血癥,肝組織細胞內炎性細胞浸潤,形成副傷寒結節。有研究表明,雞產出死胎或未足月胎兒、胚胎溶化、子宮內膜炎等都可加重敗血癥,從而繼發心、肝、脾、肺、腎等器官淤血和組織變性[23]。在本研究中,發病母兔陰門出血,子宮黏膜充血、水腫,內膜表面膿性滲出物、潰瘍,出現流產和胎兒液化,組織學觀察發現母兔肺淤血、有出血斑,脾淤血腫大,肝表面有大小不一的不規則灰白色壞死灶,表明沙門菌能夠引起母兔各器官出現病變,并降低母兔繁殖性能。

生殖器官不同程度的壞死是妊娠母兔感染沙門菌的常見病癥。已有研究表明,引起繁殖母兔流產死亡的病因可分為傳染病性疾病和機械物理性兩種類型[24]。董文秀[25]研究認為,沙門菌可使妊娠母兔發生化膿性子宮炎、子宮黏膜潰瘍,子宮顏色發黑為主的病理特征。至今,有關妊娠母兔沙門菌感染的組織病理特征鮮見報道。本研究對沙門菌引起的妊娠母兔病理組織進行觀察,發現患病母兔心、肝、脾、肺、腎組織細胞間隙均充滿紅細胞,心肌細胞排列紊亂,肝細胞水泡和脂肪變性,脾血管內皮細胞腫脹明顯;肺泡壁的毛細血管擴張。

由于沙門菌的分型較多,臨床上尚無有效的菌苗進行治療[26-28]。因此,目前沙門菌感染主要采用抗生素進行治療,但由于臨床上長期濫用抗生素,致使沙門菌出現嚴重的多重耐藥現象。劉芳萍等[29]發現,雞源沙門菌對頭孢唑啉、卡那霉素、慶大霉素4種抗菌藥物高度敏感,對四環素、氨芐西林、復方磺胺、喹諾酮類、磺胺等抗菌藥物耐藥率均較高。李珂等[30]檢測鵝源沙門菌的藥物敏感性顯示,其對磺胺類、阿米卡星、卡那霉素、β-內酰胺有較低敏感性。本研究藥敏試驗結果表明,沙門菌對丁氨卡那(氨基糖苷類)抗生素不敏感,而對氯霉素類、頭孢菌素類、青霉素類、喹諾酮類、四環類、多肽類、β-內酰胺、磺胺類抗生素具有較高的敏感性,可作為臨床用藥的依據。因此,當兔場發生該病時,根據藥敏試驗結果指導科學用藥,才能獲得良好的治療效果。在進行藥物防治的同時,也要注意制定合理的管理措施,只有樹立科學的用藥觀念,合理規范用藥并加強飼養管理,才可有效的預防沙門菌感染,減少細菌感染對兔養殖的危害。

4 結 論

本研究從病兔組織中分離出革蘭陰性菌,經分離培養、序列分析等確定為沙門菌,并對病兔組織進行組織病理學觀察。經藥物敏感性試驗檢測發現分離的沙門菌對頭孢哌酮等15種藥物敏感,對丁胺卡那有耐藥性,為沙門菌的合理防治提供了科學參考。