基于網絡藥理學分析黨參減輕大腸桿菌感染小鼠急性肺損傷的作用機制

鞏志國,趙佳敏,顧柏臣,任佩佩,于琢雅,白云潔,劉鑫煜,王 超,劉 博

(內蒙古農業大學獸醫學院,呼和浩特 010018)

黨參(Codonopsispilosula)具有補中益氣、生津、胃和健脾益肺等功效,是我國傳統的補益藥之一[1]。黨參多糖(Codonopsispilosulapolysaccharide,CPPS)是從中藥黨參中提取的主要生物活性化合物之一[2]。其具有廣泛的生物活性和藥理作用,包括調節細胞和體液免疫、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化。中醫藥具有以整體觀和辨證論治為特色的理論體系和幾千年的臨床實踐經驗,隨著醫學與生命科學研究逐漸步入大數據時代。網絡藥理學應運而生從整體的角度探索藥物與疾病間的關聯性[3]。目前,網絡藥理學已成為中醫藥研究領域的熱點和前沿。

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由直接或間接肺損傷引起的炎癥反應,是一種劇烈的肺部炎癥反應,表現為中性粒細胞聚集、間質水腫、上皮完整性破壞、蛋白滲入肺泡間隙和炎性細胞因子水平升高等[4]。重癥則為急性呼吸窘迫綜合征,可導致多器官衰竭,致死率高達30%～50%,特征是炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)的釋放及炎性細胞的流入和活化[5-6]。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)所致感染性肺損傷的病理生理變化,與常見吸入性肺損傷所致ALI的發病過程相似[7]。大量研究表明,大腸桿菌菌體成分LPS和大腸桿菌均可誘導小鼠ALI的發生[8-10]。LPS吸入是小鼠ALI的成熟試驗模型,其特征是肺組織/支氣管肺泡灌洗液中急性中性粒細胞積累和肺水腫[11]。但黨參對防治急性肺損傷的作用機制目前尚不清楚。

本研究采用網絡藥理學的方法,對黨參防治急性肺損傷進行有效成分的預測和靶點的挖掘,并從蛋白互作、分子功能,生物學過程和相關通路多角度挖掘黨參對防治急性肺損傷的潛在作用機制。使用大腸桿菌建立ALI小鼠模型,對相關的信號通路激活和細胞因子分泌情況進行驗證,并通過免疫熒光和HE染色對肺損傷進行評估。因此,該機制闡明可為獸醫臨床應用黨參來防治由細菌感染所致的急性肺損傷和相關新獸藥的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品及抗體

本研究使用的CPPS由內蒙古農業大學獸醫學院高珍珍博士饋贈,CPPS的結構表征(分子量5.3～230.6 ku),主要由Gal、Ara和Glu組成[12]。IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒均購自Biolegend公司;胎牛血清(FBS)購自ExCell Biology公司;RPMI 1640培養基和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自HyClong公司;無酶水(DNase/RNase-Free Deionized Water)購自Tiangen公司;牛血清白蛋白(BSA)購自BD Biosciences公司;酵母提取物(yeast extract)和胰蛋白胨(tryptone)均購自Oxoid公司;吐溫-20(Tween-20)購自Solarbio公司;兔抗高遷移率族蛋白B1(HMGB1/HMG1)購自NOVUSBIO公司;GAPDH抗體和山羊抗兔(Alexa Fluor 488)二抗均購自Abcam公司;組織裂解液購自Thermo Scientific公司;p65、P-p65、p38、P-p38、ERK和P-ERK抗體均購自Cell Signaling Technology公司,HRP標記山羊抗兔二抗購自Affinity Biosciences公司。

1.2 細菌培養

野生型大腸桿菌(鑒定證書號SYS110017)由本課題組分離鑒定保存。將在-80 ℃低溫保存的菌液在4 ℃環境中融化后,轉移至100 mL已滅菌的LB肉湯培養基中,在37 ℃,200 r·min-1于恒溫搖床中連續培養12 h。根據本課題組前期研究數據,使用酶標儀檢測菌液600 nm波長處的吸光值大約為0.9時,表明其處于對數生長期。將菌液混勻后取1 mL置于無菌無酶離心管中,3 000 r·min-1離心6 min,棄掉上清,用無菌PBS溶液重懸菌液3次,最后使用1 mL PBS緩沖液重懸細菌,4 ℃保存備用[13]。

1.3 黨參有效成分和靶點的獲取及靶點網絡關系圖的構建

本研究利用中藥系統藥理學分析平臺TCMSP(https:∥old.tcmsp-e.com/index.php)檢索詞“黨參”,以口服利用度≥30%,類藥性≥0.18進行初步篩選后,再按Lipinsk五原則相對分子質量≤500,氫給體數目<5,氫受體數目<10,脂水分配系數<5進行再次篩選。通過Uniprot(https:∥www.uniprot.org/)和PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取TCMSP數據庫篩出的活性成分所對應的靶點。將篩選好的活性成分及其靶點輸入Cytoscape中,構建黨參的“中藥-化合物-靶點”網絡圖。

1.4 急性肺損傷靶點的獲取及關鍵靶點篩選

以“acute lung injury”為檢索詞,使用GeneCards(https:∥www.genecards.org/)和DisGeNET(https:∥www.disgenet.org/)數據庫進行檢索,得到急性肺損傷的相關靶點,使用微生信平臺(http:∥www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖將黨參活性成分的靶點與急性肺損傷的靶點取交集,將交集靶點導入STRING(https:∥cn.string-db.org/)數據庫,選擇物種“Homosapiens”,將最低交互要求分數設置為置信度大于0.700,且隱藏網絡中斷開連接的節點,構建PPI網絡圖。

1.5 GO富集及KEGG分析

將黨參與急性肺損傷的交集靶點導入DAVID(https:∥david.ncifcrf.gov/)數據庫,選擇物種“Homosapiens”隨后得到GO富集和KEGG通路,運用微生物平臺進行可視化分析。

1.6 實驗動物及分組

本試驗所用實驗動物為C57BL/6J小鼠購自內蒙古大學實驗動物中心,本研究選用8周齡,體重23 g±2 g。隨機將小鼠分組,每組10只,即陰性對照組(uninfected)、E.coli感染組、CPPS(40、100或 250 mg·kg-1)+E.coli處理組、地塞米松(DEX)+E.coli陽性對照組。體內試驗感染前1 h腹腔注射CPPS(40、100、250 mg·kg-1),地塞米松(0.5 mg·kg-1)。菌液用PBS洗滌3次,重懸備用,鼻腔滴注30 μL菌液,大腸桿菌感染12 h后處死小鼠,收集肺,將肺組織研磨后取上清。體外細胞試驗巨噬細胞使用CPPS(6.25、12.5、25、50 μg·mL-1)預處理1 h后,使用大腸桿菌感染巨噬細胞(MOI 5∶1),感染1 h后,使用PBS清洗3次,隨后用含有10 mg·mL-1卵清蛋白和20 U·mL-1干擾素的新鮮培養基清洗細胞3次,再用PBS清洗3次,培養至24 h收集上清。按照ELISA試劑盒說明書檢測組織和細胞上清中的TNF-α和IL-1β的水平。

1.7 小鼠腹腔巨噬細胞培養和試驗處理

小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養方法基于本課題組先前的研究[14]。小鼠腹腔注射3% TG培養基2 mL。腹腔注射3% TG培養基3 d后處死小鼠。沿腹部中線將小鼠皮膚組織剪開,暴露腹膜。用無菌PBS緩慢注射到小鼠腹腔并晃動小鼠2 min,隨后吸取小鼠腹腔灌注液,直至吸取得腹腔灌注液澄清透明。將腹腔灌注液1 000 r·min-1離心5 min后棄掉上清,用無菌PBS進行重懸細胞,重復此步驟3次。用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸細胞,并將細胞濃度調至5×106·孔-1,置于5% CO2,溫度37 ℃細胞培養箱中培養過夜。

1.8 總蛋白提取和Western blot分析

將巨噬細胞使用CPPS(6.25、12.5、25、50 μg·mL-1)預處理1 h后,使用大腸桿菌感染巨噬細胞(MOI 5∶1),感染時間15和30 min。隨后進行總細胞蛋白提取,用200 μL M-PER處理巨噬細胞10 min后使用細胞刮刀收獲貼壁細胞。用BCA試劑盒測定蛋白樣品的濃度。Western blot分析采用12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠,電泳時每泳道總蛋白10 μg。隨后進行膜轉印。隨后用含3% BSA的封閉液封閉PVDF膜4 h,然后在4 ℃條件下孵育一抗14 h。一抗稀釋比例如下:p65、P-p65、p38、P-p38、ERK和P-ERK稀釋比例均為1∶1 000,GAPDH稀釋比例1∶10 000。一抗孵育完成后,用TBST緩沖液清洗3次,室溫孵育兔二抗(1∶3 000稀釋)1 h。然后用TBST清洗3次。用化學發光底物和化學發光成像系統進行圖像的采集,通過Image J軟件對試驗結果灰度值進行分析。

1.9 免疫熒光檢測和形態學觀察

采集小鼠肺在液氮中速凍,-80 ℃保存,修塊,用OTC包埋劑將修好的組織塊包埋,冰凍切片機切片,厚度為6～10 μm,4或-20 ℃保存,切片放置室溫15 min干燥,冷丙酮固定10 min,冷PBS洗2次,每次5 min,用5%的BSA封閉1 h,吸除多余的液體,4 ℃孵育HMGB1抗體過夜。次日,用含PBST洗3次,每次5 min,室溫孵育熒光二抗1 h,用含PBST洗3次,每次5 min。隨后使用激光共聚焦顯微鏡采集熒光強度。收集小鼠肺制備石蠟切片,用不同濃度的酒精(100%、75%、50%和25%)脫水。蘇木精、伊紅(H&E)染色后,掃描觀察肺病理變化。

1.10 統計分析

2 結 果

2.1 黨參的活性成分及靶點

從TCMSP數據庫中共篩選出8種符合要求的活性化學成分,如表1所示。同時找到黨參活性成分對應靶點對應的急性肺損傷靶點交集119個,運用Cytoscape軟件構建網絡圖,如圖1所示。

表1 黨參的主要活性成分

紅色橢圓.黨參;綠色三角.黨參活性成分;橙色方形.靶點

2.2 黨參治療急性肺損傷的潛在靶點及蛋白互作(PPI)網絡分析

通過疾病相關數據庫篩選出1 522個與急性肺損傷相關的靶點,其中與黨參的交集靶點共119個,并繪制PPI圖發現黨參與急性肺損傷的靶點與NF-κB、MAPK和TLR4之間存在緊密關聯,如圖2所示。

圖2 黨參治療急性肺損傷的潛在靶點及PPI網絡分析

2.3 富集分析

通過富集篩選與急性肺損傷相關的生物過程和分子功能,結果如圖3所示。生物過程主要包括肽基酪氨酸磷酸化,跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路,蛋白質磷酸化,MAPK級聯的正調控,激酶活性正調控和蛋白質自磷酸化等。此外,分子功能主要包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性,蛋白酪氨酸激酶活性,ATP結合和蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析表明,NF-κB信號通路、MAPK信號通路和TNF信號通路等信號通路在黨參治療中發揮關鍵作用。

2.4 黨參多糖對大腸桿菌誘導巨噬細胞中MAPK和NF-κB信號通路激活及炎癥因子分泌的影響

探究CPPS對大腸桿菌誘導的巨噬細胞中MAPK和NF-κB信號通路激活的影響,以及對促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β分泌水平的影響。結果表明,大腸桿菌感染可誘導巨噬細胞分泌高水平的TNF-α和IL-β,如圖4所示。CPPS(6.25、12.5、25和50 μg·mL-1)預處理均能降低大腸桿菌感染后巨噬細胞TNF-α和IL-1β的分泌。此外,與大腸桿菌感染后15 和30 min相比,CPPS預處理組ERK、p65和p38磷酸化水平明顯降低,如圖4所示。上述結果表明在大腸桿菌感染過程中,CPPS可影響巨噬細胞MAPK信號通路中p38和ERK以及NF-κB信號通路中p65的激活,以及促炎性細胞因子和趨化因子的分泌。

2.5 黨參多糖對大腸桿菌感染誘導的小鼠體內炎性細胞因子TNF-α和IL-1β產生的影響

CPPS預處理C57BL/6J野生型小鼠后,檢測炎性細胞因子TNF-α和IL-1β分泌的情況。如圖5所示,CPPS預處理可顯著下調大腸桿菌感染誘導的小鼠肺中TNF-α、IL-1β的產生。上述結果表明,CPPS可降低大腸桿菌感染誘導的炎性細胞因子的產生,且具有劑量依賴性。

與大腸桿菌組相比,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;與空白對照組相比,#.P<0.05

2.6 黨參多糖對大腸桿菌誘導損傷標記物HMGB1蛋白表達和肺病理損傷的影響

C57BL/6J小鼠腹腔注射CPPS預處理后,用1×108CFU大腸桿菌鼻腔滴注小鼠后取肺組織,檢測小鼠肺中HMGB1的表達情況,如圖6所示。相比于未處理組,使用CPPS處理組小鼠在大腸桿菌感染時肺組織的熒光強度中位數較低,提示HMGB1表達處于較低水平。此外,通過HE染色結果可觀察到對照組小鼠肺基本正常,未見明顯病理變化,而大腸桿菌感染組病變較為嚴重,表現為大部分肺泡間質變寬,有的區域可見大量中性粒細胞滲出,當使用CPPS預處理后,再使用大腸桿菌感染肺損傷程度顯著下調,表現為部分區域肺泡間質稍有增寬,輕度淤血。上述結果表明,CPPS可下調大腸桿菌感染誘導的肺中HMGB1的表達并可減輕肺的損傷。

與大腸桿菌組相比,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;與空白對照組相比,#.P<0.05

3 討 論

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種嚴重的呼吸系統疾病,目前缺乏有效的治療方法導致死亡率較高[15-16]。ALI的特征是肺間隙和肺實質中無法控制的高炎癥反應,包括肺泡毛細血管膜損傷、血管通透性增加和中性粒細胞募集增多[17]。黨參作為一種常用中藥具有補中益氣和健脾益肺的功效[18]。研究表明,黨參在防治慢性阻塞性肺,呼吸窘迫綜合征和間質性肺病等肺部相關疾病具有重要作用[19-21]。但黨參對ALI的作用目前尚不清楚,因此本研究通過網絡藥理學和分子生物學試驗相結合的方式探究黨參對ALI的作用機制,以期為獸醫臨床防治急性肺損傷及相關新獸藥的研發提供理論依據。

本研究發現黨參發揮作用的網絡中核心靶點主要包括PTGS1、PTGS2、IL2、PDGFRA、JAK3、JAK2、JAK1、CXCR1、CXCR2、NOS1、TGFBR1、MIF、TLR4、TLR9、ZAP70、MAPK1、MAPK8、MAPK10、MAPK14、MAP2K1、NFKB1、HSP90AA1、PPARA、MPO、PLG等。前列腺素在炎癥反應的產生中起著關鍵作用,在炎癥組織中的生物合成顯著增加,并有促進急性炎癥的發展,因此被認為是一種高效的炎性介質[22]。PTGS1和PTGS2基因編碼的環加氧酶COX-1和COX-2催化前列腺素合成的速率限制步驟,這是炎癥的關鍵調節因子[23]。眾所周知,Janus激酶(JAK1、JAK2和JAK3)是多種細胞因子信號通路的重要介質,存在于正常的細胞過程和免疫介導的炎癥[24]。大量研究表明,白細胞介素-8(CXCL8/IL-8)受體趨化因子受體1型(CXCR1)和趨化因子受體2型(CXCR2)可作為ALI的潛在治療靶點[25]。MIF參與了LPS誘導的ALI的發病機制,可能是ALI的治療靶[26]。哺乳動物細胞中,有4組主要的傳統MAPKs信號通路ERK1/2(分別稱為MAPK3和MAPK1)、ERK5、JNKs(JNK1、JNK2和JNK3)分別稱為(MAPK8、MAPK9和MAPK10)和p38 MAPKs (p38alpha、p38beta、p38gamma和p38delta分別稱為(MAPK14、MAPK11、MAPK12和MAPK13)[27]。MPO參與了包括在ALI內的多種疾病,如嚴重膿毒癥和ARDS。綜上所述,本文通過網絡藥理學方法得到的核心基因可從調節炎癥反應、炎癥信號通路相關基因表達等方面在急性肺損傷過程中發揮關鍵作用。

通過GO和KEGG富集分析發現,黨參防治急性肺損傷的靶基因主要參與MAPK級聯活化密切相關、膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質結合和ATP結合等相關生物功能,而且相關靶基因主要富集在MAPK、NF-κB和TNF等信號通路中。研究表明,包括ALI在內的各種炎癥性疾病均涉及巨噬細胞通過NF-κB或MAPK信號通路介導細胞因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β),以及炎癥介質(如NO和PGE2)表達[28]。然而,黨參是否通過以上關鍵通路調節急性肺損傷,還有待進一步的驗證。

大量研究表明,大腸桿菌感染可誘導ALI[9]。本研究使用大腸桿菌感染建立小鼠ALI模型。CPPS是黨參提取的一種多糖,具有廣泛的生物活性和藥理作用,包括免疫調節、清除自由基、造血等[12,29]。CPPS在炎癥反應、疾病的預防和治療等方面被廣泛應用[30]。研究表明,在大腸桿菌感染過程中可激活MAPK和NF-κB信號通路進而介導炎癥介質的分泌[31]。CPPS對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子分泌具有調控作用,且可減輕了葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎的臨床癥狀[32]。

上述網絡藥理學研究結果表明,NF-κB或MAPK信號通路在急性肺損傷中具有重要作用,因此通過Western blot檢測CPPS對大腸桿菌誘導MAPK和NF-κB信號通路激活的影響。結果表明,CPPS可減弱大腸桿菌感染誘導的MAPK(p38和ERK)和NF-κB(p65)的激活。MAPK和NF-κB信號通路激活減弱預示炎癥反應轉歸[33]。此外,當細胞破損HMGB1釋放到細胞外可引起炎癥,并刺激先天免疫細胞遷移和激活,因此將其作為組織損傷相關分子模式成員之一[34]。在ALI發生是促炎反應的增加和抗炎反應的減少,大量的炎癥細胞因子(如IL-6和TNF-α)被分泌出來,導致細胞因子風暴的發展,從而導致呼吸衰竭[35]。結果表明,CPPS可降低肺中TNF-α和IL-1β的分泌以及HMGB1的表達,因此CPPS對大腸桿菌感染所致急性肺損傷具有保護作用。

4 結 論

黨參可通過下調MAPK(p38和ERK)和NF-κB(p65)炎癥信號通路的激活對TNF-α和IL-1β的分泌進行調控,從而降低肺的損傷程度及病理變化。此外,黨參多糖對大腸桿菌誘導的急性肺損傷具有較好的防治作用,但具體作用機制還需進一步研究。