去亞甲基小檗堿對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體caspase依賴性凋亡的影響

朱天立　孫琳　王炳超　馬澤剛

［摘要］目的探討去亞甲基小檗堿（DMB）對1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導的SH-SY5Y細胞線粒體caspase依賴性凋亡通路的影響。方法培養SH-SY5Y細胞，將其分為對照組、MPP+組、小檗堿（BBR，DMB的前體）＋MPP+組、司萊吉蘭（selegiline，與DMB同為單胺氧化酶B抑制劑）＋MPP+組、DMB＋MPP+組。應用免疫印跡法檢測各組bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白的表達。結果與對照組相比，MPP+組bcl-2/bax比值明顯降低（F=42.58，q=17.89，P<0.001），DMB、BBR、selegiline處理均可以抑制MPP+誘導的bcl-2/bax比值降低（q=6.71～10.63，P<0.001），且selegiline處理效果強于BBR和DMB（q=3.93、3.59，P<0.05）。與對照組相比，MPP+組cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調（F=111.60，q=29.44，P<0.001），DMB、BBR、selegiline處理可以降低MPP+誘導的cleaved caspase-3蛋白表達上調（q=10.74～13.53，P<0.001），且3種藥物處理效果差異無顯著性。結論對于MPP+誘導的SH-SY5Y細胞，DMB可以升高bcl-2/bax比值，降低cleaved caspase-3蛋白的表達。

［關鍵詞］小檗堿；SH-SY5Y細胞；線粒體；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；細胞凋亡

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0375-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.095［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230804.1522.005;2023-08-0417：38：52

EFFECTS OF DEMETHYLENEBERBERINE ON MITOCHONDRIAL CASPASE-DEPENDENT APOPTOSIS IN SH-SY5Y CELLS INDUCED BY MPP+ZHU Tianli， SUN Lin， WANG Bingchao， MA Zegang （Department of Physiology， School of Basic Me-dicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of demethyleneberberine （DMB） on the mitochondrial caspase-dependent apoptosis pathway in SH-SY5Y cells treated with 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）. MethodsSH-SY5Y cells were cultured and divided into control group， MPP+ group， berberine （BBR， the precursor of DMB）+MPP+ group， selegiline （a monoamine oxidase B inhibitor similar to DMB）+MPP+ group， and DMB+MPP+ group. The ratio of bcl-2/bax and the expression of cleaved caspase-3 protein were determined by Western blot for each group. ResultsCompared with that in the control group， the bcl-2/bax ratio in the MPP+ group was significantly lower （F=42.58，q=17.89，P<0.001）. DMB， BBR， and selegiline all significantly inhibited the MPP+-induced decrease in the bcl-2/bax ratio （q=6.71-10.63，P<0.001）， and the effect with selegiline was significantly greater than that with BBR （q=3.93，P<0.05） and that with DMB （q=3.59，P<0.05）. Compared with the control group， the MPP+ group showed significantly higher expression of cleaved caspase-3 protein （F=111.60， q=29.44，P<0.001）. DMB， BBR， and selegiline significantly reduced MPP+-induced upregulation of cleaved caspase-3 protein （q=10.74-13.53，P<0.001）， with no significant difference in the treatment effects of the three drugs （P>0.05）.? ConclusionFor SH-SY5Y cells induced by MPP+， DMB can increase the ratio of bcl-2/bax and decrease the expression of cleaved caspase-3 protein.

［KEY WORDS］berberine; SH-SY5Y cells; mitochondria; caspase 3; apoptosis

帕金森?。≒D）是一種神經退行性疾病，常見于老年人，其主要特征為黑質致密部多巴胺能神經元的選擇性喪失[1-2]。導致PD的原因有很多，例如神經炎癥、氧化應激、單胺氧化酶B（MAO-B）活性異常等。臨床治療PD的方式多為藥物治療[3]。去亞甲基小檗堿（DMB）是小檗堿（BBR）的主要代謝產物之一，被認為是BBR生物發生途徑的中心中間體[4]。有研究表明，DMB具有抗氧化、抗炎、抗纖維化以及可逆抑制MAO-B活性的特性，提示DMB可能在神經退行性疾病中具有治療潛力[5-7]。眾所周知，線粒體相關的bcl-2/bax/caspase-3凋亡途徑是一條非常典型的caspase依賴性凋亡途徑。有研究結果表明，bcl-2、bax蛋白表達水平的變化，會激活caspase-3，啟動caspase-3級聯反應[8-11]。本研究用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）處理SH-SY5Y細胞建立體外PD模型，觀察DMB以及已經被證明具有保護作用的DMB前體BBR、同樣為MAO-B抑制劑的司來吉蘭（selegiline）對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白表達水平的影響。

1材料和方法

1.1實驗材料

SH-SY5Y細胞購于中國科學院上海細胞庫；DMEM高糖培養液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素溶液購自以色列Biological Industries公司；MPP+、BBR、selegiline和DMB購自美國GLP-BIO公司；兔抗bcl-2、兔抗bax、兔抗cleaved caspase-3和兔抗GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司；HRP標記山羊抗兔IgG 購自中國Abclonal公司；ECL發光液購于中國雅酶公司。

1.2細胞培養及分組

SH-SY5Y細胞置于溫度為37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中，用DMEM高糖培養液培養，該培養液中含有體積分數0.10的胎牛血清和體積分數0.01的青霉素/鏈霉素。細胞培養2～3 d后進行傳代，將狀態良好的細胞接種于6孔板中，進行下一步實驗。將細胞分為對照組（A組）、MPP+組（B組）、BBR＋MPP+組（C組）、selegiline＋MPP+組（D組）、DMB＋MPP+組（E組）。A組不做任何處理；B組使用1 mmol/L的MPP+處理SH-SY5Y細胞24 h；C組使用0.1 μmol/L的BBR和1 mmol/L的MPP+共同處理SH-SY5Y細胞24 h；D組使用100 μmol/L的selegiline和1 mmol/L的MPP+共處理SH-SY5Y細胞24 h；E組使用1 nmol/L的DMB和1 mmol/L的MPP+共處理SH-SY5Y細胞24 h。

1.3免疫印跡法檢測bcl-2、bax、cleaved caspase-3蛋白的表達

各組SH-SY5Y細胞經過藥物處理24 h后，用PBS洗滌3次，每孔加入100 μL RIPA裂解緩沖液在冰上裂解30 min。用刮板將細胞刮下，經離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）提取細胞蛋白。使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。將含有20 μg蛋白質的樣品通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，隨后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將膜置于50 g/L的脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，然后分別加入bcl-2（1∶1 000）、bax（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次10 min，加山羊抗兔IgG（1∶10 000）二抗室溫孵育1 h。用ECL發光液顯影，然后使用Image J軟件分析bcl-2、bax和cleaved caspase-3蛋白表達。

1.4統計學分析

應用Graphpad Prism 7.0軟件進行統計學分析。實驗數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），然后采用Turkey法進行組間兩兩比較，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1DMB對MPP+處理的SH-SY5Y細胞bcl-2/bax比值的影響

各組細胞bcl-2/bax比值比較差異具有統計學意義（F=42.58，P<0.001）。與對照組相比，MPP+組細胞的bcl-2/bax比值顯著降低（q=17.89，P<0.001）；與MPP+組相比，DMB＋MPP+組、BBR＋MPP+組和selegiline＋MPP+組的bcl-2/bax比值明顯升高，差異有統計學意義（q=6.71～10.63，P<0.001）；與BBR＋MPP+組和DMB＋MPP+組相比較，selegiline＋MPP+組bcl-2/bax比值更高（q=3.59、3.93，P<0.05）；DMB＋MPP+組與BBR＋MPP+組相比，bcl-2/bax比值差異無統計學意義。見圖1、表1。

2.2DMB對MPP+處理的SH-SY5Y細胞cleaved caspase-3蛋白的影響

各組細胞cleaved caspase-3蛋白水平比較差異具有統計學意義（F=111.60，P<0.001）。與對照組相比，MPP+組的cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著上調（q=29.44，P<0.001）；與MPP+組相比，DMB＋MPP+組、BBR＋MPP+組、selegiline＋MPP+組的cleaved caspase-3蛋白表達降低，差異具有統計學意義（q=10.74～13.53，P<0.001）；3種藥物處理組之間相比，cleaved caspase-3蛋白表達水平差異無顯著性。見圖1、表1。

3討論

PD是一種常見于老年人的神經退行性疾病[12]，其主要病理特征為黑質致密部多巴胺能神經元的選擇性喪失、路易小體（主要成分為α-突觸核蛋白）形成[13]。PD的臨床表現主要包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態障礙，同時病人可伴有抑郁、便秘和睡眠障礙等非運動癥狀[14]。臨床治療方式主要為藥物治療，包括多巴胺類似物、多巴胺受體激動劑、神經保護劑等。手術治療是藥物治療的一種有效補充；康復治療、心理治療及良好的護理也能在一定程度上改善癥狀[15-16]。有效的治療能顯著提高PD病人的生活質量，PD病人的預期壽命與普通人群并無顯著差異[17]。

DMB存在于天然藥用植物蕓香科植物黃柏中，亦可由鹽酸小檗堿經過肝臟的首過效應代謝生成。DMB是BBR的主要代謝產物之一，是BBR生物合成的關鍵中間體，并且DMB在通過血-腦脊液屏障和發揮治療作用方面比BBR更加有效。DMB具有抗氧化、抗炎、抗纖維化的特性。許多研究表明，DMB能抑制絲裂原活化蛋白激酶信號[18]，參與抑制核因子κB，因此認為DMB可以作為一種神經保護藥物用于治療PD[19]。而且，由于DMB可促進AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）信號傳導，推測它可能通過調節AMPK的信號傳導而有助于PD的神經保護[20]。有大量證據表明，多巴胺是MAO-B的底物，MAO-B抑制劑可以通過增加多巴胺含量治療PD[21]。而有研究表明，DMB可以可逆地抑制MAO-B活性[22]。良好的生物活性使得DMB成為一個有吸引力的合成靶點，DMB可能在神經退行性疾病中具有治療潛力[23]。

已知MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）的有毒代謝產物[24]，其結構接近多巴胺，會通過中腦多巴胺轉運蛋白被選擇性地轉運進入神經元，選擇性地毒害多巴胺能神經元，從而導致PD的癥狀[25]。本研究應用MPP+制備體外PD模型，探究DMB對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體caspase依賴性凋亡通路的影響。本實驗結果顯示，經MPP+處理的SH-SY5Y細胞bcl-2/bax比值降低，cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加。這表明細胞在受到損傷后bcl-2/bax比值會降低，并且伴隨著cleaved caspase-3蛋白含量的增加。有研究表明，BBR對MPTP誘導的PD模型小鼠多巴胺能神經元損傷具有保護作用[26]。另有研究表明，selegiline作為一種MAO-B抑制劑，對神經元的損傷具有保護作用[27-28]。為了檢測DMB是否具有細胞保護作用，本研究使用DMB的前體BBR以及同為MAO-B抑制劑的selegiline與DMB進行對照，而這兩種藥物均已被證實具有細胞保護作用。有研究表明，bcl-2具有抗凋亡作用[29]。bax接收到凋亡信號刺激被激活后會破壞線粒體膜的完整性，釋放cyt-c，進一步將caspase-3剪切為具有凋亡活性的cleaved caspase-3[30]。本實驗結果顯示，DMB處理能夠有效抑制MPP+誘導引起的bcl-2/bax比值的降低，而且，MPP+誘導引起的cleaved caspase-3表達的升高在經DMB處理之后也會被抑制。BBR、selegiline、DMB雖然都有明顯的抑制MPP+誘導引起的bcl-2/bax比值降低的作用，但selegiline的效果要略強于BBR和DMB，而DMB與BBR之間并無明顯差別。BBR、selegiline、DMB均具有明顯的抑制MPP+誘導引起的cleaved caspase-3表達升高的作用，且3種藥物作用效果無明顯差異。推測這種現象產生的原因可能為：DMB與BBR同為小檗屬植物的天然產物，在特性上具有一定的相同之處，而selegiline并非天然植物產物，在作用方式上可能會與小檗屬植物天然產物有所不同，從而在作用效果上產生差異。但其具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，本實驗初步證明，DMB能夠通過升高bcl-2/bax比值、降低cleaved caspase-3蛋白表達，抑制線粒體caspase依賴性的凋亡途徑，從而對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞起到保護作用。本研究為DMB作為神經保護藥物治療PD提供了新的方案，但DMB起保護作用的深層機制還有待繼續研究。

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（本文編輯馬偉平）