百令膠囊上調(diào)miR-145-5p 逆轉(zhuǎn)TGF-β1/Smad3通路機制初探*

馮 平，姬澤萱，陳麗萍，王 布

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、動物與細(xì)胞

儀器：Finepointe 型無限制肺功能測試體積描記儀（美國Buxco 公司）；DSX1000 型光學(xué)顯微鏡和攝影系統(tǒng)、BX53 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；SJ - 8 型微孔板讀取器（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CR30NX 型離心機（美國Eppendorf 公司）；UV2700 型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）。

試藥：BLC（杭州中美華東制藥有限公司，批號為2005118D）；卷煙（芙蓉王濾嘴卷煙，湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，批號為063814，每支含焦油11 mg、尼古丁1.0 mg、一氧化碳12 mg）；Smad3 一抗（美國Cell Signaling Technologies 公司，批號為ybs9316）；Alexa Fluor 488共軛二抗（英國Abcam 公司，批號為330192）；4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，批號為Az402），Trizol 試劑（批號為R0024），DMEM 培養(yǎng)基（批號為1105119），均購自美國Invitrogen公司；CCK-8分析試劑盒（日本Dojindo公司，批號為abs50013）；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（天津一安生物技術(shù)有限公司，批號為DB203F）；TaqMan microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號為T90F42）、SYBR green（批號為S9137），均購自美國Applied Biosystems 公司；Mayer 蘇木精（批號為A200407），1%伊紅（批號為A217362），均購自南京生航生物技術(shù)有限公司；10% 胎牛血清（FBS，批號為SH30070.03），100 IU/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素（批號為J130061），均購自美國Hyclone公司。

動物：SD大鼠，雌雄各半，年齡6～8 周，體質(zhì)量（200 ±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2022 - 0008。在相對濕度（50±10）%、溫度（25±2）℃和光照（12 h 光/暗循環(huán)）下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食飲水。

菌種及細(xì)胞：肺炎克雷伯菌（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為M2019851）；BEAS-2B 細(xì)胞株（美國細(xì)胞培養(yǎng)收藏中心，編號為H-EMC-63）。

1.2 方法

1.2.1 在體實驗

模型建立［7］：將大鼠置密閉空間（50 cm × 60 cm ×70 cm），暴露于8 支香煙的煙霧中，每天2 次，每次30 min，前2 周內(nèi)無煙間隔3 h；隨后的10 周內(nèi)，暴露于15 支香煙的煙霧中，每天3 次，每次30 min，無煙間隔3 h。前8 周內(nèi)每5 天接種1 次肺炎克雷伯菌懸液（6 ×108cfu/mL，100μL）。對照大鼠暴露于空氣中。

分組及給藥：建模第9 周，將60 只大鼠分為正常對照組（2 mL 生理鹽水）、模型組（2 mL 生理鹽水）、BLC 組（5.5 mg/kg［8］）、miR-145-5p inhibitor 陰性對照片段（inhibitor NC）組［5.5 mg/kg BLC+6μL（0.02 nmol/μL生理鹽水）inhibitor NC］、miR-145-5p inhibitor（inhibitor）組［5.5 mg/kg BLC+6μL（0.02 nmol/μL 生理鹽水）inhibitor］，各12 只。大鼠分別灌胃相應(yīng)藥物及生理鹽水，每天1 次，連續(xù)8 周；inhibitor NC 及inhibitor 以尾靜脈給藥，每周1 次，連續(xù)8 周。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號K2020047）。

主要對波紋結(jié)構(gòu)對流動的影響進(jìn)行分析，取入口速度恒為1m/s。設(shè)為速度入口邊界；壓力出口邊界，壓力值為0Pa；管道壁面設(shè)為無滑移邊界。

肺功能：大鼠予腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉，置連接Buxco 氣流傳感器的參考室內(nèi)。每4 周評估1 次潮氣量（TV）、呼氣峰流量（PEF）和分鐘通氣量（MV）。第16 周，麻醉大鼠，測定用力肺活量（FVC）和第0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3）。

病理形態(tài)：末次給藥后，收集大鼠左下葉肺組織樣本，用10%過氧化氫（H2O2）溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm 厚切片。1）用Mayer 蘇木精和1%伊紅染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察。使用Adobe Photoshop CC 軟件的計數(shù)工具計算肺泡平均線性截距（μm）和平均肺泡數(shù)（單位面積為1 mm2）。2）將切片在二甲苯中脫蠟，用分級乙醇水合；置121 ℃高壓滅菌器中10 min 提取抗原，在25 ℃條件下、以3%H2O2孵育0.5 h 以阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。將切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，并用10% 山羊血清孵育0.5 h，然后與Smad3 的一抗（1∶500，V/V）孵育過夜。次日，在37 ℃條件下用過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育60 min，再用3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行免疫染色，以蘇木精進(jìn)行復(fù)染，置光學(xué)顯微鏡下觀察。

TGF - β1表達(dá)：末次給藥后，取0.2 g 大鼠肺組織，于2 mL生理鹽水中勻漿，1 000 r/min離心15 min，得上清液，用ELISA法測定TGF-β1的表達(dá)水平。

miR - 145- 5p mRNA 表達(dá)：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法。以Trizol法提取RNA，鑒定其純度和完整性并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；PCR 反應(yīng)條件為，95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40 次；72 ℃延伸5 min 終止反應(yīng)。RT-qPCR 反應(yīng)結(jié)束后，定量分析獲得的熔解曲線和擴增曲線結(jié)果，并設(shè)定循環(huán)閾值（Ct），以U6 小RNA 為內(nèi)源性對照，用2-ΔΔCt法計算RNA 的相對表達(dá)量。引物如下：miR - 145 - 5p（正向，5' - GGACGGACAGGGAGGCCAAA - 3'；反向，5' - TTTGGCCTCCTCTCGCTCGCGCGTCC - 3'）和U6（正向，5' - CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向，5'-AACGCTTCGCGCAGGCAA-3'）。各組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.2 離體實驗

香煙煙霧提取物（CSE）制備［9］：將2 支點燃香煙的煙霧鼓入10 mL DMEM 培養(yǎng)基中，并經(jīng)0.22μm 過濾器濾過，制備新鮮原始溶液，測定吸光度（OD）。將320 nm波長處的溶液作為100%CSE。

BLC 藥物血清（BLC - S）制備：取10 只大鼠，均灌胃5.5 mg/kg BLC，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h，腹主動脈取血，3 000 r/ min 離心15 min，取上清液；56 ℃條件下滅活30 min，經(jīng)0.22 μm 過濾器濾過，得BLC-S，貯藏于-80 ℃，備用。另取10 只大鼠灌胃等體積生理鹽水，同法制備空白血清。

細(xì)胞活力：采用CCK-8法檢測。BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 IU/mL 青霉素和100μg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔3 000 個的細(xì)胞密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，孵育12 h，將細(xì)胞暴露于0（空白對照），3%，5%，10%，20% CSE中，加5%，10%，20%，40%BLC - S 孵育48 h；加10 μL CCK - 8 溶液孵育2 h，檢測450 nm 波長處的OD。細(xì)胞活力（%）=（ODBLC-S-ODblank）/（ODcon-ODblank）×100%。實驗重復(fù)3次。

TGF-β1表達(dá)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以BEAS-2B細(xì)胞與5%CSE 和20%BLC - S 孵育48 h，收集培養(yǎng)基，3 000 r/ min 離心15 min，取上清液，用ELISA 法測定TGF-β1的表達(dá)水平。

Smad3 表達(dá)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，與5%CSE 和20%BLC-S 孵育48 h，4 ℃條件下以4%多聚甲醛冰涼溶液固定20 min，用0.5%Triton X - 100 滲透，用3%BSA在室溫下封閉1 h。將細(xì)胞與Smad3一抗（1∶200，V/V）在4 ℃下孵育過夜；洗滌，將細(xì)胞與Alexa Fluor 488 共軛二抗（1∶5 000，V/V）在室溫下孵育2 h；洗滌，用DAPI對細(xì)胞核染色5 min，置熒光顯微鏡下觀察。

miR-145-5p mRNA表達(dá)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將BEAS - 2B 細(xì)胞與5%CSE 和20%BLC - S 孵育48 h。按相應(yīng)方法檢測miR-145-5p mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺功能

與正常對照組比較，模型組大鼠TV，MV，PEF，F(xiàn)VC，F(xiàn)EV0.3均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BLC 組及inhibitor NC 組大鼠上述指標(biāo)均顯著升高（P＜0.05）；與inhibitor NC 組比較，inhibitor組大鼠上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖1（其中與正常對照組/ 空白對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組/5%CSE 條件比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與inhibitor NC 組/5%CSE+20%BLC-S+inhibitor NC 條件比較，&P＜0.05。圖2，圖4至圖7同。）。

圖1 各組大鼠肺功能指標(biāo)Fig.1 Lung function indicators in each group

圖2 各組大鼠肺泡數(shù)及直徑Fig.2 Alveolus count and diameter in each group

2.2 大鼠肺組織病理形態(tài)

模型組大鼠肺組織出現(xiàn)如肺泡破壞和肺泡腔擴張等嚴(yán)重病理變化。與模型組比較，BLC組及inhibitor NC組大鼠肺組織病理形態(tài)顯著改善，平均肺泡數(shù)顯著增加，肺泡直徑顯著減?。≒＜0.05）；與inhibitor NC 組比較，inhibitor組大鼠肺組織病理形態(tài)未改善，且平均肺泡數(shù)顯著減少，肺泡直徑顯著增長（P＜0.05）。詳見圖2、圖3。

圖3 各組大鼠肺組織形態(tài)（HE，×100）Fig.3 Morphology of lung tissue in each group（HE，× 100）

2.3 細(xì)胞活力

5%CSE作用48 h時，細(xì)胞活力降低約50%（圖4 A）。與空白對照比較，5%～40%BLC-S 未顯示出明顯的細(xì)胞毒性（圖4 B），故選擇20%BLC-S 為后續(xù)實驗濃度。與5%CSE 條件比較，5%CSE+20%BLC-S 條件下的細(xì)胞活力顯著增強（P＜0.05，圖4 C）。

圖4 細(xì)胞活力Fig.4 Cell viability

2.4 Smad3 表達(dá)水平

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中Smad3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，BLC 組和inhibitor NC 組大鼠肺組織中Smad3 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與inhibitor NC 組比較，inhibitor 組大鼠肺組織中Smad3 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖5 A。與空白對照比較，5%CSE 條件下細(xì)胞中Smad3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與5%CSE 條件比較，5%CSE+20%BLC-S 條件下細(xì)胞Smad3表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與5%CSE + 20%BLC - S + inhibitor NC 條件比較，同水平inhibitor 條件下細(xì)胞Smad3 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖5 B。

圖5 Smad3的表達(dá)Fig.5 Expression of Smad3

2.5 TGF-β1 表達(dá)水平

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，BLC 組和inhibitor NC 組大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與inhibitor NC 組比較，inhibitor組大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖6 A。與空白對照比較，5%CSE條件下細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與5%CSE 條件比較，5%CSE+20%BLC-S條件下細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與5%CSE + 20%BLC -S+inhibitor NC 條件比較，同水平inhibitor 條件下細(xì)胞TGF - β1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖6 B。

圖6 TGF-β1的表達(dá)水平Fig.6 Expression level of TGF-β1

2.6 miR-145-5p mRNA 表達(dá)水平

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中miR -145 - 5p mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BLC 組及inhibitor NC 組大鼠肺組織中miR -145-5p mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與inhibitor NC 組比較，inhibitor 組大鼠肺組織中miR-145- 5p mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。詳見圖7 A。與空白對照比較，5%CSE 條件下細(xì)胞中miR - 145 - 5p mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與5%CSE 條件比較，5%CSE + 20%BLC - S 條件下細(xì)胞miR - 145 - 5p mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖7 B。

圖7 miR-145-5p mRNA的表達(dá)水平Fig.7 Expression level of miR-145-5p mRNA

3 討論

吸煙被認(rèn)為是COPD 的主要風(fēng)險因素［1］。長期暴露于煙霧會增加輕度穩(wěn)定期COPD 模型小鼠肺組織纖維化［10］。有研究表明，COPD 患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用BLC 后，其肺通氣換氣功能、呼吸困難等不適癥狀有了顯著改善［11］。本研究中證明了BLC 可抑制COPD 模型大鼠肺功能下降、病理改變和纖維化反應(yīng)；此外，BLC能增強暴露于CSE 的BEAS-2B細(xì)胞活力，并阻斷細(xì)胞中TGF-β1/Smad通路。

持續(xù)暴露于CSE 會導(dǎo)致肺部miRNA 的失調(diào)，這與各種呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，如肺結(jié)核、哮喘、肺癌及COPD［12］。暴露于香煙的COPD 模型大鼠肺組織中miR - 145 下調(diào)，并且已提出miR - 145 表達(dá)水平與COPD 的診斷密切相關(guān)［13］。miR - 145 - 5p 水平降低與5～12 歲哮喘兒童人群的肺生長早期下降有關(guān)，并且基線miR-145-5p水平降低也與隨訪結(jié)束時（23～30歲）研究人群的COPD發(fā)生相關(guān)［6］。本研究中，在COPD模型大鼠肺組織及暴露于CSE 的BEAS - 2B 細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)miR-145-5p 水平顯著下調(diào)，而BLC 顯著逆轉(zhuǎn)了該趨勢。此外，miR - 145 - 5p inhibitor 的加入明顯逆轉(zhuǎn)了BLC 對COPD 模型大鼠的保護(hù)作用，體現(xiàn)在肺功能指標(biāo)降低，平均肺泡數(shù)減少和平均線性截距增長。表明BLC可通過上調(diào)miR-145-5p水平發(fā)揮COPD保護(hù)作用。

有研究證實，miR - 145 - 5p 上調(diào)能減輕COPD 模型大鼠肺組織纖維化程度［9］。TGF-β1介導(dǎo)的Smad3 信號在與煙霧刺激、博來霉素激發(fā)和腫瘤進(jìn)展/發(fā)展相關(guān)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的關(guān)鍵作用已得到證實［14］。TGF-β1信號通過跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉(zhuǎn)導(dǎo)，將1 型受體內(nèi)化到核內(nèi)體中，用于受體激活的Smad 錨與Smad3 復(fù)合物的形成。之后Smad 在絲氨酸殘基處磷酸化，促進(jìn)Smad2/3 和Smad4 之間的相互作用，然后易位到細(xì)胞核，并通過與Smad 結(jié)合元件相互作用來調(diào)節(jié)EMT 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［15-16］?；赟mad3 在TGF- β1介導(dǎo)的EMT 過程中發(fā)揮更關(guān)鍵作用，本研究中重點關(guān)注BLC對TGF-β1/Smad通路的影響。結(jié)果證實，在COPD模型大鼠肺組織和暴露于CSE 的BEAS - 2B 細(xì)胞中TGF-β1/Smad 信號通路激活，BLC 顯著抑制了該通路激活。進(jìn)一步分析顯示，miR-145-5p inhibitor的加入阻斷了BLC對TGF-β1/Smad信號通路的抑制作用。但本研究還存在一定局限性，除TGF-β1/Smad 外，還應(yīng)研究與纖維化進(jìn)展相關(guān)的其他信號，包括PI3K/Akt 和ERK。

綜上所述，BLC在體內(nèi)和體外均顯示出對香煙誘導(dǎo)COPD的保護(hù)作用，其機制可能與上調(diào)miR-145-5p水平逆轉(zhuǎn)暴露香煙激活的TGF-β1/Smad3信號通路有關(guān)。