雌激素對乳腺癌干細胞增殖、自我更新的作用研究

周勤梅，王 競，喻允伶△

（1. 重慶市銅梁區人民醫院，重慶 402560； 2. 重慶醫科大學基礎醫學院，重慶 400016）

據最新統計，乳腺癌已成為全球女性第一大癌癥［1］，發病率和死亡率均較高。乳腺癌發生與環境、激素、表觀遺傳、基因突變、生活方式等多種因素相關。目前，針對乳腺癌的主要治療手段有手術切除及輔助放射治療和化學藥物治療（簡稱放化療）等。盡管在乳腺癌治療方面已取得很大進展，但仍有20%～30%的復發/ 轉移率［2-3］。因此，繼續深入研究乳腺癌復發、轉移、耐藥的分子機制，尋求乳腺癌早期診斷及治療新靶點具有重要意義。乳腺癌干細胞（BCSC）是相對于乳腺癌細胞的獨立細胞亞群，具有典型的自我更新能力，且可特異性與乳腺癌細胞表面抗原結合。本研究團隊前期研究發現，雌激素可促進人乳腺癌細胞MCF-7增殖及MCF - 7 可誘導干細胞表達，但具體機制尚未明晰。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是哺乳動物腫瘤免疫中重要的信號通路，在70%惡性腫瘤的癌變過程中發揮了極重要的作用［4-6］。本研究中驗證了MCF 細胞具有乳腺癌干細胞特性，探討不同濃度雌激素對BCSC 的增殖和自我更新作用機制，以為雌激素用于乳腺癌的臨床治療提供實驗數據和新的思考策略。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞

儀器：CX23 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；FLX800 型酶標儀（BioTek 公司）；SpectraMax M5 型熒光定量梯度聚合酶鏈式反應儀（美國MD公司）。

試劑：雌二醇（批號為E8875-1G），聚甲基丙烯酸-2 - 羥乙酯（Poly - HEMA，批號為P3932 - 10G），均購自美國Sigma 公司；DMEM/ F12 培養基（批號為31331093），人白細胞抗原B27（批號為A1486701）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，批號為13256 - 029）、表皮生長因子（批號為RP-8661），均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；牛血清白蛋白（BSA，批號為A8010），胰島素（批號為I8830），均購自北京索萊寶科技有限公司；Anti - CD44 抗體（批號為ab189524），Anti -CD24抗體（批號為ab202073），均購自Abcam公司。

細胞：MCF 細胞系（中國科學院細胞庫，編號SCSP-531）。

1.2 方法

1.2.1 BCSC 的培養

取Poly-HEMA 1.2 g，加入95%乙醇，置10 mL 容量瓶，定容，37 ℃搖床溶解過夜，經0.22 μm 過濾器濾過，制成體積分數為1.2%的Poly - HEMA；取適量，鋪6孔板，每孔1 mL，超凈工作臺放置過夜；使用前以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗不少于2 遍；每孔加入1 × 104個MCF - 7 細胞，并加入BCSC 培養基（組成：100 mL DMEM / F12 培養基中加入2 mL 人白細胞抗原B27、2 μg bFGF、20 μg EGF、0.4 g BSA、500 μg 胰島素和100μL肝素2 mL）培養。

1.2.2 細胞免疫熒光實驗

收集上述培養液中懸浮的BCSC（第2代），使用胰蛋白酶消化，置1 mL離心管中，PBS浸洗3 min，1 000 r/min離心5 min，平行3 次；用4%多聚甲醛固定BCSC，室溫過夜，0.5%Triton X-100（以PBS 配制）室溫通透20 min，PBS 浸洗3 min，1 000 r/min 離心5 min，平行3 次，吸干PBS。在離心管內加入正常山羊血清，室溫封閉30 min，1 000 r/ min 離心5 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBS浸洗細胞3 min，1 000 r/min 離心5 min，平行3次，吸干多余液體后滴加熒光二抗（CD24/CD44），暗處孵育1 h；PBS浸洗3 min，1 000 r/min離心5 min，浸洗3 次后，滴加DAPI 染核，避光孵育5 min，PBS浸洗3 min，1 000 r/min離心5 min，平行3 次，吸干多余液體；用含抗熒光淬滅劑的封片液重懸細胞并封片，置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 BCSC 的生長

采用CCK-8法。將BCSC以1×105/孔密度接種于96 孔板中，每孔分別加入含0，1，5，10，20，100 nmol/L雌激素的完全培養基培養。細胞貼壁后，分別于0，24，48，72 h 時以CCK - 8 試劑孵育1 h。采用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度（OD）值，并對數據進行分析。

1.2.4 BCSC 的自我更新

采用Mammosphere形成實驗將BCSC以1×105/孔密度接種于96孔板中，加入含0，10，20 nmol/L 雌激素的完全培養基培養24 h，使細胞貼壁生長。顯微鏡下觀察孵育48 h 后的BCSC 球形態，拍照。并統計成球率（細胞成球標準為緊密的非多細胞懸浮性球體，直徑大于50μm）。細胞成球率（%）=細胞球體數/每孔所接種細胞數×100%。

1.2.5 相關基因mRNA 的表達

采用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法。以不同濃度（0，1，5，10 nmol/ L）雌激素處理BCSC 24 h 后，提取BCSC 的總RNA，計算RNA 濃度。取1 μg RNA，逆轉錄為cDNA，采用熒光定量PCR 法檢測PI3K，AKT，mTOR mRNA的表達水平。。

1.2.6 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計學軟件分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BCSC 的獲得

經連續2 周培養，從MCF-7 細胞中成功培養出了BCSC（見圖1），且其中CD44 顯著表達，而CD24 不表達（見圖2）。

圖1 乳腺癌干細胞的培養Fig.1 Culture of BCSCs

圖2 乳腺癌干細胞的鑒定Fig.2 Identification of BCSCs

2.2 BCSC 的生長情況

與0 nmol/L 比較，1，5，10 nmol/L 雌激素作用下，BCSC 增殖能力顯著升高，且隨著雌激素濃度的升高和作用時間延長，BCSC 的增殖能力逐漸增強；但當雌激素濃度大于10 nmol/L 時，BCSC 的生長開始受到顯著抑制（除0 h外，P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 乳腺癌干細胞的生長情況Fig.3 Growth of BCSCs

2.3 BCSC 自我更新情況

與0 nmol/L 比較，10 nmol/L 和20 nmol/L 雌激素作用下BCSC 體積均顯著增大，數量顯著增多（見圖4）；當雌激素濃度為20 nmol/ L 時，BCSC 的2 個指標均低于濃度為10 nmol/L時。

圖4 乳腺癌干細胞自我更新情況Fig.4 Self-renewal of BCSCs

2.4 BCSC 相關基因mRNA 的表達

與0 nmol/L 比較，1，5，10 nmol/L 雌激素作用下，BCSC 的PI3K，AKT，mTOR mRNA 表達水平均顯著升高（P＜0.05），且在低濃度（1，5，10 nmol/ L）雌激素作用下存在濃度依賴性（見圖5）。

圖5 乳腺癌干細胞相關基因mRNA的表達Fig.5 Expression of related gene mRNA in BCSCs

3 討論

近年來，手術切除和內分泌靶向治療在乳腺癌治療中已取得顯著進展，但復發和轉移仍然是乳腺癌患者面臨的兩大死亡原因［7］。臨床醫師常長期補充雌激素治療婦科內分泌疾病，但該治療方法存在很大爭議。有研究報道，補充雌激素會顯著增加罹患婦科腫瘤的概率，但同時也有研究者發現，這種療法可減少婦科腫瘤的發生［8］。通過病例比對發現，長期服用雌二醇（E2）的絕經期婦女的卵巢癌發病率比未服用E2者提高了55%；分析1966年至2006年大部分相關研究發現，雌激素療法實可顯著增加卵巢癌的發生風險。絕經期婦女補充雌激素者乳腺癌發病率相較未補充者可顯著升高［9-10］。

國外近年有研究報道，不同濃度雌激素對MCF-7細胞生長的影響不同，其中，高濃度（20 nmol/ L）雌激素對MCF - 7 細胞生長有一定抑制作用［11-12］，但高濃度的雌激素對MCF - 7 細胞的抑制作用可能并不依賴于雌激素受體，不同濃度的雌激素作用于MCF - 7 細胞，可能產生不同效果。另有報道表明，雌激素對胸腺癌腫瘤的發生發展、對化療耐藥及復發轉移過程也存在相同作用［13］。本研究結果顯示，10 nmol/L 雌激素作用24 h可明顯促進BCSC的自我更新能力，但20 nmol/L雌激素反而抑制其自我更新。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路的異常激活與癌細胞的增殖、膀胱癌干細胞（BCSC）的存活和耐藥性密切相關。RTK，GPCRs，Ras 可激活PI3K，激活后的PI3K 可活化其下游因子AKT 和PDK1。此外，mTOR，p70S6K，4E-BP1 和糖原合成酶激酶3（GSK3）是AKT 的下游效應因子，可被AKT 激活，以刺激癌細胞的蛋白質合成、生長、增殖和遷移［14-15］。本研究結果顯示，經雌激素誘導后，BCSC 的PI3K，AKT，mTOR mRNA 的表達水平均顯著升高，且存在濃度依賴性，這可能意味著較低濃度（10 nmol/ L）的雌激素能有效促進PI3K/ AKT/ mTOR信號通路相關基因的表達。

綜上所述，低濃度（10 nmol/L）雌激素可提高BCSC的增殖、自我更新能力，此作用可能涉及PI3K/ AKT/mTOR信號通路，但仍需進一步研究。