某市29 批市售黨參藥材飲片高效液相色譜指紋圖譜建立及化學計量學研究*

劉亮亮，孫 紅，武林芝，安 琪

（山西衛生健康職業學院藥學院，山西 晉中 030619）

黨參始載于《本草從新》，為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsistangshen Oliv. 的干燥根［1］，其性平、味甘，歸脾、肺經，有健脾益肺、養血生津功效［2-3］。現代藥理學研究表明，黨參具有調節血糖、增強機體免疫力和抗胃潰瘍等多種作用［4-7］。2019 年，黨參被列入藥食同源物質試點名單［8］，黨參藥材飲片需求量也大幅增加，同時對其質量規范性提出了更高要求。目前，黨參藥材飲片等級劃分標準不統一，導致市售品質量參差不齊。2020 年版《中國藥典（一部）》對其的規定僅有鑒別、檢查和浸出物等項［1］，質量控制的研究多以測定其中某個或幾個成分的含量為主［9-10］，高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜質量評價也主要是針對某一特定地區藥材，如嶺南特色飲片熟黨參及其生品的研究［11］。有研究采用指紋圖譜結合化學計量學實現了對黨參藥材及其炮制品的全面綜合評價［12-13］，但缺乏對市售黨參藥材飲片質量的研究。中藥指紋圖譜為現代質量控制模式，能整體表征中藥質量［14-16］。中藥化學模式識別解決了中藥質量多維信息的綜合分析問題，能更全面地體現中藥的內在品質［17-19］。鑒于此，本研究中采用HPLC 指紋圖譜結合化學計量學方法（含聚類分析和主成分分析）對太原市市售不同廠家29批黨參藥材飲片質量進行了綜合評價，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；1000Y 型藥材粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；LK/CSJ-30型超聲波清洗機（成都老肯醫療科技股份有限公司）；XPE105型電子天平、XSE204型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度分別為0.01 mg和0.1 mg）；Fresco 21型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 試藥

黨參炔苷對照品（天津諾爾醫藥技術有限公司，批號1506567，含量99.21%）；黨參苷Ⅰ對照品、黨參炔苷寧對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號分別為CHB180123，CHB200721，含量≥98%）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為娃哈哈純凈水。太原市市售黨參藥材飲片29 批（來源信息見表1，除S5，S19，S21 樣品產地為山西省外，其余樣品產地均為甘肅省），經山西衛生健康職業學院楊翠玲副教授鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula的干燥根。

表1 太原市市售29批黨參藥材飲片樣品信息Tab.1 Information of 29 batches of commercial Codonopsis Radix Decoction Pieces in Taiyuan

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立與相似度評價

2.1.1 色譜條件

色譜柱：WatersXSelect?HSST3柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.5%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min 時5%B → 10%B，20～70 min 時10%B →30%B，70～100 min 時30%B →60%B，100～115 min 時60%B →85%B，115～120 min 時85%B →95%B）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：220 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取黨參苷Ⅰ對照品8.77 mg，黨參炔苷寧對照品8.43 mg，黨參炔苷對照品9.45 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，分別加適量甲醇溶解并定容，搖勻，制成質量濃度分別為1.75，1.69，1.89 mg/mL的單一對照品貯備液；各精密量取適量，用50%甲醇稀釋，配制成質量濃度分別為100.0，200.0，400.0μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：將樣品粉碎，過3 號篩，取粉末2 g，精密稱定，平行2份，置150 mL具塞錐形瓶中，加入90%甲醇30 mL，稱定質量，超聲（功率250 W、頻率50 kHz，下同）提取30 min，取出，室溫冷卻，再次稱定質量，用90%甲醇補足減失的質量，搖勻，取1.5 mL，置2 mL離心管中離心10 min，取上清液，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 方法學考察

精密度試驗：取供試品溶液適量，按2.1.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，以黨參炔苷峰為參照峰，記錄峰面積和保留時間。結果各成分色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰為參照峰，記錄峰面積和保留時間。結果各成分色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品粉末2 g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰為參照峰，記錄峰面積和保留時間。結果各成分色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.4 指紋圖譜建立

取29 批樣品粉末，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖；將色譜圖數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），以編號S1樣品的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度設為0.1 min，采用多點校正自動匹配，采用中位數法生成對照圖譜（R），建立黨參藥材飲片HPLC 指紋圖譜的共有模式。29 批樣品的疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜分別見圖1 和圖2。共標定18 個共有峰，比對后指認出其中3個，分別為黨參苷Ⅰ峰（7號峰）、黨參炔苷寧峰（10 號峰）和黨參炔苷峰（11 號峰）。黨參炔苷為黨參中主要藥效成分，且峰面積較大、保留時間適中，故作為參照峰（s），將參照峰的保留時間和峰面積記為1，得各批樣品色譜峰相對保留時間的RSD為0.1%～0.8%，相對峰面積的RSD為19.0%～90.3%，表明不同批次樣品化學成分含量差異較大。

圖1 29批黨參藥材飲片高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

圖2 黨參藥材飲片高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.1.5 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）評價29批樣品的相似度，結果見表2。28批樣品（S7除外）與對照指紋圖譜相似度為0.853～0.974，表明太原市市售黨參藥材飲片一致性較好。由圖1 可見，28 批樣品化學成分基本一致，僅含量有差異，其中4號峰（未鑒定出）和7，10，11 號峰為含量較高的主要色譜峰。S7 樣品中這4個成分的含量明顯低于其他樣品，是導致相似度較低的主要原因。

表2 29批黨參藥材飲片相似度評價結果Tab.2 Results of similarity evaluation of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.2 化學計量學分析

2.2.1 聚類分析

以18個共有峰的峰面積為變量，導入SPSS 20.0統計學軟件，選擇平方歐式距離測度進行聚類分析，聚類方法采用組間連接，聚類結果見圖3。當分類距離為5時，29 批樣品可聚為3 類，其中S4，S14，S16 - S21，S23 -S24，S27 - S29 聚為一類，S1 - S3，S5 - S6，S8 - S13，S15，S22，S25 - S26 聚為一類，S7 單獨聚為一類。產地相同、廠家一致且相似度接近的樣品被聚為一類，如來自河北一達藥業有限公司的樣品S9，S11，S22，S25，安國市廣濟堂藥業有限公司的樣品S8，S15，S26被聚為一類，從而可較好地區分質量存在差異的樣品。

圖3 29批黨參藥材飲片聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.2.2 主成分分析

采用SPSS 20.0 統計學軟件對29 批樣品的18 個共有峰峰面積進行主成分分析，特征值與方差貢獻率結果見表3，成分特征值碎石圖見圖4。以提取特征值大于1為原則，可得到5 個主成分因子，其累計方差貢獻率達84.175%（＞80%），故可將樣品的18個成分簡化為5個主成分進行分析。

表3 樣品共有峰峰面積主成分分析結果Tab.3 Results of PCA of common peak area of samples

為使上述提取的主成分更清晰全面地反映樣品原始數據所含信息，以最大方差法對變量進行正交旋轉，得到旋轉后的成分矩陣（表4）。以5 個主成分因子為變量繪制載荷圖（圖5）。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大［20］。1-4、9-11，5-8、12，1、13-14，15-16，17-18分別在主成分1，2，3，4，5上有相對較高的載荷，以29 批樣品的18 個共有峰峰面積為變量，導入SIMCA 14.1 軟件，采用非監督模式識別方法進行主成分分析，結果29批樣品可分為3組，與聚類分析結果基本一致。

圖5 主成分載荷圖Fig.5 Loading plot of PCA

表4 旋轉后公共因子載荷矩陣表Tab.4 Public factor loading matrix after rotation

為綜合評價太原市市售黨參飲片的整體質量，根據相應主成分的權重系數計算綜合得分（得分越高，表明樣品整體質量越好），并據此對不同批次樣品質量排序［21］。詳見表5 和圖6。由表5 可知，不同批次樣品綜合得分差異較大，其中S19 樣品綜合得分最高，S7 樣品綜合得分最低。通過聚類與綜合得分結果整體分析，第一類（S1等）樣品質量最優，第二類（S4等）樣品質量次之，第三類（S7）樣品質量最差。

圖6 29批黨參藥材飲片的主成分得分圖Fig.6 PCA scoring plot of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

表5 29批黨參藥材飲片主成分得分、綜合得分及排名Tab.5 Score，comprehensive score and rank of principal components in 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

3 討論

3.1 提取條件優化

預試驗中分別以不同體積分數甲醇（100%，50%，70%，90%），乙醇（90%，100%，50%，70%）為提取溶劑，結果顯示，提取溶劑為90%甲醇時，提取成分較多且主要色譜峰含量較高；對超聲時間（15，30，45 min）和超聲溶劑體積（15，30，45 mL）進行了考察，結果超聲溶劑體積為30 mL、超聲提取30 min效果較好。

3.2 色譜條件考察

預試驗中對供試品溶液進行全波長掃描（190～400 nm），結果顯示，在220 nm 波長處色譜峰數量較多、響應值較高且色譜峰峰形較好，故選擇220 nm 為檢測波長；考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus、Agilent Zorbax StableBond和Waters XSelect?HSS T3這三類色譜柱（規格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm），結果HSS T3 色譜柱對極性較大的化合物有相對較好的保留，且在較短的分析時間內實現目標化合物的較好分離；考察了流動相中不同添加劑（甲酸和磷酸）及其不同體積分數（0.1%磷酸、0.2%磷酸和0.5%磷酸）對色譜分離的影響，結果發現，以乙腈-0.5%磷酸水溶液為流動相時基線相對平穩，分離良好；考察了不同柱溫（30，35，40 ℃）對結果的影響，結果顯示，分離度隨柱溫升高顯著改善，分析時間縮短，但柱溫為40 ℃時反而影響分離度，故柱溫選擇35 ℃；考察了不同流速（1.0，1.2，1.5 mL/min）對結果的影響，結果發現，流速提高，分析時間縮短，但影響色譜峰分離，故選擇流速為1.0 mL/min。

3.3 結果分析

本研究結果顯示，太原市市售黨參藥材飲片化學成分一致性較好（S7 樣品除外），29 批樣品可聚為3 類。綜合得分排序結果表明，同一產地不同廠家樣品存在質量差異，同一廠家不同批次樣品質量也有優劣之分。主成分分析是在盡可能保持原有數據信息的前提下，通過降維處理的方法達到簡化評價指標的目的。本研究中共得到5 個主成分，其中色譜峰1 - 4、9 - 11，5-8、12，1、13-14，15-16，17-18對各個主成分的貢獻較大，是導致太原市市售黨參藥材飲片質量差異的主要成分，峰面積較大的色譜峰4 是影響S7 樣品質量的主要色譜峰之一，但色譜峰3，4，8，10，16，18 在本研究中尚未得到指認，該部分相關性研究仍需借助液質聯用、核磁共振等手段進一步確認，方可作為市售黨參藥材飲片的質量控制指標。后續研究將建立質量控制指標含量測定方法，進一步加強黨參藥材飲片質量控制，以保證產品的均一性。同時，本研究中發現，產地對黨參藥材飲片質量優劣也有重要影響，故需擴大不同產地樣本量進一步考察產地對市售黨參飲片的影響，以更全面地為黨參藥材飲片的質量研究提供參考。

綜上所述，本研究中將指紋圖譜、聚類分析及主成分分析結合，可全面評價市售黨參藥材飲片的質量，為其質量的規范性研究提供了參考。