電子束輻照對肉豆蔻藥材質量及滅菌效果的影響*

戈雅倩，謝和兵，4△，尼瑪次仁，白瑪旦增

（1. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012； 2. 江蘇省南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3. 江蘇神猴醫藥研究有限公司，江蘇 南通 226133； 4. 西藏神猴藥業有限責任公司，西藏 日喀則 857000）

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁，廣泛栽培于熱帶地區，國內主要分布于廣東、云南等地，香辛味濃烈，有溫中行氣、澀腸止瀉之效［1-2］。有研究表明，肉豆蔻富含黃酮類、揮發油、木脂素、苯丙素等有效成分［3］，有抗癌［4］、抗炎［5-6］、抗心肌缺血［7］、抗氧化［8］、預防腦損傷［9］等藥理作用。去氫二異丁香酚是肉豆蔻的指標性化學成分。藏醫藥中，肉豆蔻常以生粉入藥用于治療心血管疾病［10］，但在其加工過程中易出現變質、腐敗等問題，影響藥品儲存和用藥安全［11-12］。故采取適宜的滅菌工藝是中藥產業化的重要部分［13］。本研究中采用電子加速器對肉豆蔻樣品進行不同劑量的電子束輻照，通過比較樣品輻照前后的高效液相色譜（HPLC）圖、去氫二異丁香酚含量、總黃酮含量及微生物總數，評價電子束對肉豆蔻藥材的輻照效應，為電子加速器輻照技術應用于肉豆蔻藥材及含藥材中成藥的滅菌提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Essentia LC-16型高效液相色譜儀（配有SPD-16型紫外檢測器）、UV-1900i型紫外分光光度計，均購自日本Shimadzu 公司；XSR205DU/ AC 型電子天平（美國Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；WMS - 1037 型生物光學顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）；UC - 250DE 型超聲波清洗儀（上海精其儀器有限公司）；TGL-16B 型臺式高速離心機（常州中捷實驗儀器制造有限公司）；DX-10/20 型電子加速器（中廣核戈瑞＜深圳＞科技有限公司）。

1.2 試藥

去氫二異丁香酚對照品（批號為17838 - 201804，含量為98.6%），蘆丁對照品（批號為100080-202012，含量為92.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。肉豆蔻藥材（安徽援康中藥飲片股份有限公司，批號為210501），經江蘇神猴醫藥研究有限公司謝和兵高級工程師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》標準。

2 方法與結果

2.1 樣品制備及輻照處理

取藥材適量，打成細粉，過2號篩，分裝于鋁箔袋密封，每袋12 g，共30 袋；采用電子加速器對樣品進行輻照滅菌處理，輻照劑量分別為0，2，4，6，8，10 kGy，得到空白對照樣品和5種輻照樣品。

2.2 去氫二異丁香酚含量測定

色譜條件：色譜柱為Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（75∶25，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為274 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

溶液制備：取去氫二異丁香酚對照品適量，精密稱定，用甲醇制成質量濃度為30 μg/mL 的對照品溶液。取樣品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率250 W、頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

精密度、穩定性、重復性試驗：按相關要求進行方法學考察。結果精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定，方法重復性良好。

含量測定：取對照品溶液和供試品溶液各適量，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。理論板數按去氫二異丁香酚峰計應不低于3 000。按外標法計算去氫二異丁香酚的含量。結果，各輻照樣品中去氫二異丁香酚含量與空白對照樣品間的差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 樣品去氫二異丁香酚和總黃酮含量測定結果（，n=3）Tab.1 Results of the content determination of dehydrodiisoeugenol and total flavonoids in the samples（，n=3）

表1 樣品去氫二異丁香酚和總黃酮含量測定結果（，n=3）Tab.1 Results of the content determination of dehydrodiisoeugenol and total flavonoids in the samples（，n=3）

輻照劑量（kGy）t值t值P值0.24 0.28 0.86 0.16 0.32 P值-1.04-3.02 0.06 2.34 3.61 0 2 4 6 8 1 0去氫二異丁香酚含量（mg/g）2.52±0.02 2.53±0.00 2.54±0.00 2.52±0.01 2.48±0.03 2.48±0.01 0.41 0.10 0.96 0.14 0.07總黃酮含量（mg/mL）1.18±0.02 1.04±0.07 1.22±0.02 1.20±0.08 1.33±0.02 1.28±0.04 1.63-1.45 0.21-2.22-1.31

2.3 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）處理色譜圖，以空白對照樣品色譜圖為參照，經過多點校正、全譜峰匹配，生成對照圖譜，并計算相似度。結果所有樣品間相似度均不低于0.998，共識別37 個共有峰，保留時間的RSD均小于2.0%。HPLC圖見圖1（R1為去氫二異丁香酚對照品，S1-S6分別為0，2，4，6，8，10 kGy輻照劑量樣品，表2同）。

表2 樣品高效液相色譜圖相似度評價Tab.2 Similarity evaluation of HPLC chromatograms of samples

2.4 總黃酮含量測定

供試品溶液制備：取樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用60%乙醇補足減失的質量，搖勻，4 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

線性關系考察：取蘆丁對照品0.010 88 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，得質量濃度為0.201 mg/mL的對照品貯備液；分別精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置10 mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL、10%氯化鋁溶液0.3 mL、4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，靜置6 min，加水定容，搖勻，靜置15 min。以不加對照品的空白試劑為對照，于510 nm波長處測定吸光度。以待測成分質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.013 2X-0.004 5（r=0.999 9，n=5）。結果顯示，蘆丁質量濃度在0.010 0～0.050 2 mg/ mL 范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度、穩定性、重復性試驗：按相關要求進行方法學考察。結果精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定，方法重復性良好。

含量測定：取樣品適量，按上述制備方法制備供試品溶液，以回歸方程計算含量，按去氫二異丁香酚含量測定項下方法處理數據。結果，輻照樣品中總黃酮含量與空白對照樣品間的差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.5 微生物檢查

參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法、通則1106非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法及通則1107 非無菌藥品微生物限度標準，對樣品進行隨機取樣，檢查細菌、霉菌和酵母菌、大腸菌群總數，均平行2次。結果樣品在輻照前后均未檢出大腸菌群；隨著輻照劑量的增加，細菌總數、霉菌和酵母菌總數均顯著降低（P＜0.05）。當輻照劑量為8 kGy 時，細菌總數遠低于藥典中非無菌藥品微生物限度標準，且未檢出霉菌和酵母菌；當輻照劑量為10 kGy時，未檢出上述微生物。詳見表3。

表3 樣品微生物檢測結果（n=2）Tab.3 Results of microbial test of samples（n=2）

3 討論

3.1 輻照滅菌的應用

中藥材的微生物控制是中藥材質量提高的重要指標。常規的中藥材滅菌方法主要為干熱、濕熱、微波等熱滅菌方式［14］。肉豆蔻藥材中含有大量的揮發性成分，常規的熱滅菌易導致揮發性成分的逸失。輻照滅菌是一種冷滅菌技術［14-15］，具有溫度低、穿透性高等優勢，尤其適用于肉豆蔻藥材等含揮發性成分或熱不穩定性成分藥材的滅菌。傳統的輻照滅菌以60Co 為主，但存在建設及防護成本高、滅菌周期長等弊端，應用受限。電子束輻照是一種新興的輻照滅菌技術，具有能量可控、束流定向、滅菌周期短、建設及防護成本低等優勢，在醫療器械、生物醫藥、中藥、食品滅菌領域應用廣泛。

3.2 中藥輻照滅菌的效應評價

常規的中藥滅菌效應評價以性狀、顯微鑒別、薄層鑒別為定性指標，以微生物總數、單個或多個指標成分的含量為定量指標，但不能全面評價滅菌前后中藥物質成分的變化，導致滅菌質量不可控，影響臨床療效。本研究中從微生物含量、去氫二異丁香酚含量、總黃酮含量、HPLC圖的相似度4個角度評價滅菌效應，可確保微生物控制水平符合2020 年版《中國藥典》規定，也能全面評價中藥物質成分的變化，為中藥材的滅菌效應評價提供參考。

3.3 研究的實用性

本研究中模擬生藥打粉、鋁箔袋密封、運輸并輻照滅菌，并根據《中藥輻照滅菌技術指導原則》［16］，設定最高輻照劑量為10 kGy。不足之處，不同產地、生產廠家的肉豆蔻藥材的固有微生物數量和種群、產品自身的水分和密度、外包裝、輻照設備的劑量等因素均會影響輻照的滅菌效果；在實際貯藏過程中，中藥材由于原料加工方法和環境衛生狀況不同，初始微生物含量也有所差異［17］。故在進行大批量產業化輻照處理時，應根據原藥材的加工、儲存條件、包裝條件及其初始微生物的總數來確定合適的輻照劑量。

綜上所述，不同劑量電子束輻照對肉豆蔻藥材質量無顯著影響，且輻照劑量達8 kGy時滅菌效果良好。