血篩傳染病核酸混樣檢測與血清學實驗并行檢測流程的探索

張珺珂,楊洪崗

(云南昆明血液中心檢驗科,云南 昆明 650106)

核酸檢測技術(Nucleic acid test,NAT)與酶聯免疫檢測技術(ELISA)的聯合使用,使經血液傳播傳染病的發生率明顯降低。目前在我國大部分血站使用的是混樣核酸檢測系統[1]?；鞓雍怂釞z測流程大多采用血清學核酸順序檢測,但此模式檢測流程耗時較長,且受血清學檢測通量制約。若采用血清學與核酸并行檢測可縮短檢測流程耗時。血站技術操作規程(2019版)規定核酸檢測流程可以使用血清學與核酸順序檢測及血清學與核酸并行檢測兩種流程[2],為探討混樣核酸檢測模式,采用血清學與核酸并行檢測流程是否可行進行本研究?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本中心2018年12月-2019年5月血清學核酸順序檢測無償獻血者標本87048份及2019年12月-2020年5月血清學核酸并行檢測的無償獻血者標本82618份。

1.2 設備

MICROLAB STAR全自動核酸混樣提取系統,EZbead System-32全自動核酸提取儀、ABI 7500實時熒光擴增分析儀。

1.3 試劑

華益美乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒(1+2)核酸檢測試劑盒(批號:MA20190907;MA20191008;MA20191210)、科華乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒核酸檢測試劑盒(批號:20190812;20191101)、浩源乙型肝炎、丙型肝炎、人 類免疫缺陷病毒核酸檢測試劑盒(批號:NF20190604;BA20200401)。

1.4 實驗室信息管理系統

啟奧SHINOW 9.0血站信息管理系統。

1.5 方法

2 結果

2.1 各檢測系統并行檢測、順序檢測混樣陽性率、拆分陽性率、試劑損耗率對比,結果所示華益美系統乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(Hepatitis B virus-Deoxyribonucleic acid,HBV-DNA)、人類免疫缺陷病毒核糖核酸(Human immunodeficiency virus-ribonucleic acid,HIV-RNA)項目兩種檢測模式混樣檢測陽性率與拆分檢測陽性率無統計學差異,丙型肝炎病毒核糖核酸(Hepatitis C virus-ribonucleic acid,HCV-RNA)項目混樣檢測陽性率存在統計學差異,試劑損耗率存在統計學差異。結果所示科華系統HBV-DNA項目兩種檢測模式混樣檢測陽性率與拆分檢測陽性率無統計學差異;HIV-RNA項目混樣檢測陽性率存在統計學差異,拆分檢測陽性率無統計學差異;試劑損耗率存在統計學差異。結果所示浩源系統HBV-DNA項目兩種檢測模式混樣檢測陽性率存在統計學差異,拆分檢測陽性率無統計學差異,試劑損耗率存在統計學差異,見表1。

表1 華益美系統、科華系統、浩源系統順序檢測及并行檢測情況

2.2 血清學核酸并行檢測乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)血清學陽性率對比,結果所示以上三種病毒血清學陽性率存在統計學差異,見表2。

表2 血清學核酸并行檢測HBV、HCV、HIV血清學陽性率對比表

3 討論

核酸混樣檢測為多份樣本匯集成一個標本池(Pool)后再進行提取和擴增,若Pool檢測結果為有反應性則需進行拆分檢測。因此使用混樣核酸檢測的實驗室需先完成血清學檢測,然后再對血清學無反應性標本進行核酸檢測,以避免血清學陽性標本進入核酸檢測,從而產生大量反應性Pool。此流程從標本接收到報告發布所需時間較長,而且血清學未檢測的標本不能進行核酸檢測,核酸檢測通量受血清學檢測通量的限制。采用血清學核酸并行檢測流程可縮短標本接收到最終報告發布所需時間,且不受血清學檢測通量的限制可發揮混樣核酸檢測高通量的優勢。

由于HCV抗體、HIV抗原或抗體、HCV-RNA、HIV-RNA陽性率均較乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和HBV-DNA低[3,4],在統計樣本量不大的情況下可能存在抽樣誤差,本文中僅對HBV-DNA項目的混樣陽性率和拆分陽性率進行討論。結果2.1所示,剔除血清學陽性標本造成的核酸混樣陽性Pool后,統計各檢測系統并行檢測和順序檢測的HBV-DNA混樣陽性率及拆分陽性率發現,華益美系統及科華系統HBV-DNA混樣陽性率及拆分陽性率,并行檢測與順序檢測無顯著差異,但浩源系統HBV-DNA混樣陽性率并行檢測與順序檢測存在顯著差異。華益美系統與科華系統均為磁力板下吸磁珠進行磁珠與液相分離,分離時磁珠始終保持在深孔板內,磁珠之間通過氣溶膠污染的可能較小。而浩源系統為磁棒上吸磁珠進行磁珠液相分離,分離時磁珠吸附在磁棒上離開深孔板,檢測強陽性標本時磁棒間磁珠可能通過氣溶膠產生交叉污染。同時各系統試劑靈敏度、試劑特異性、防污染能力都存在差異,最終導致三個系統血清學核酸并行檢測與順序檢測拆分陽性率和混樣陽性率統計學結果的不同,但各系統無論并行檢測還是順序檢測的NAT總陽性率以及拆分陽性率均在報道的范圍內[1,5-7],由此可見,在做好實驗室清潔消毒[8]和實驗過程控制的前提下,實驗室發生嚴重污染,而產生假陽性的可能較低,但需關注的是在實驗室清潔消毒過程中,如高頻次使用高濃度含氯消毒劑進行清潔消毒,有增加設備故障率的風險[9]。

本研究進行統計的試劑損耗率中,血清學核酸順序檢測試劑損耗率符合本中心之前的報道[10]及其他文獻報道[11],但血清學核酸并行檢測與血清學核酸順序檢測存在顯著差異,并行檢測試劑損耗率高于順序檢測試劑損耗率。這是由于并行檢測在混樣時存在血清學陽性標本,血清學陽性標本會導致混樣陽性Pool的數量增加從而增加拆分檢測的數量,同時大量血清學陽性標本進入核酸檢測流程,也一定程度增加了核酸檢測混樣假陽性的發生率。而試劑損耗的增加會直接導致血站檢測成本的上升。

從結果中2.2中可以看出,進行并行檢測的82618份標本中所檢測出的血清學陽性標本中乙肝占69.8%,顯著高于丙肝的11.3%和艾滋的18.9%。若在采血前的初篩檢測時使用高靈敏度的膠體金免疫層析試劑;并通過培訓加強初篩檢測人員的責任心和對膠體金法檢測結果的正確判定,防止在采血人次較多、工作疲勞等情況下,因人為因素導致膠體金免疫層析試劑陽性標本漏檢的情況,可以進一步減少血清學陽性標本。從而降低血清學核酸并行檢測時乙肝血清學陽性對核酸檢測的影響。

綜上所述,核酸混樣檢測與血清學實驗并行檢測可以縮短整個檢測流程所需時間,且不會因為大量血清學陽性標本進入核酸檢測而產生大量的假陽性結果,但會增加試劑的損耗率,導致檢測成本的增加和資源的浪費。因此混樣核酸檢測與血清學并行檢測不宜作為常規的檢測流程,但在自然災害、傳染病疫情等,檢測時間緊或檢測樣本量大的突發特殊情況下可縮短檢驗科整個血液檢測流程所需時間,是一種有效、可行的應急檢測流程,也可為血站實驗室建立應急檢測方案的體系文件提供參考。