水飛薊素對神經膠質瘤的體內外抑制作用及機制Δ

劉 明，劉熙鵬，李 淳，甄 誠，劉春江，王海洋，鞏建青（河北北方學院附屬第一醫院神經外科，河北 張家口 075000）

膠質瘤是成人中樞神經系統常見的惡性原發性腦腫瘤[1]。神經膠質瘤是膠質瘤的常見類型之一，具有侵襲性，且患者預后不佳[2]。由于大腦中樞神經系統結構的特殊性（如存在血腦屏障），使得藥物研發面臨諸多挑戰[2]。盡管研究者在腫瘤診斷方式和治療策略方面取得了新的進展，但神經膠質瘤患者的病死率仍然很高[3]。因此，尋找更有效的神經膠質瘤治療手段十分必要。

水飛薊素（silymarin，SM）是一種多酚類黃酮，具有抗氧化、抗癌等多種生物活性[4]。據報道，SM 可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，促進其凋亡[5]；同時，其可抑制膠質瘤皮下移植模型裸鼠體內腫瘤的生長[6]。以上研究均表明，SM具有一定的抗癌活性。相關研究顯示，抑制蛋白激酶B（protein kinase B，又稱Akt）/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路可抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[7]；SM 可通過MAPK 信號通路來促進人肺腺癌A549 細胞的凋亡[8]。可見，Akt/MAPK信號通路可能是SM調控神經膠質瘤等腫瘤細胞增殖、凋亡的潛在途徑之一。基于此，本研究擬探討SM對人神經膠質瘤細胞增殖、凋亡及裸鼠體內移植瘤生長的影響，并通過Akt/MAPK信號通路探究其潛在作用機制，為神經膠質瘤的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BPN-50CH型CO2培養箱（上海五久自動化設備有限公司）、ST-360 型酶標儀（上?？迫A實驗系統有限公司）、FACS Calibur型流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）、DYCZ-MINI 4 型四板垂直電泳儀（北京六一儀器有限公司）、CX33型顯微鏡（日本Olympus 公司）、EC3 型凝膠成像系統（美國UVP 公司）等。

1.2 主要試劑

SM 對照品（批號XKB0213，純度≥98%）購自上海晅科生物科技有限公司；SC79對照品（Akt激活劑，批號HY-18749，純度≥98%）購自美國MCE 公司；CCK-8 試劑盒（批號CK04）購自深圳市紐邦生物科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號CA001）購自南京萊富賽生物科技有限公司；兔源增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、Akt、p38 MAPK、胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG 二抗（批號分別為ab29、ab32124、ab32503、ab32351、ab8805、ab170099、ab184699、ab38449、ab178867、ab278538、ab8245、ab6721）均購自英國Abcam公司；DMEM培養基（批號MED-1001）購自武漢賽奧斯生物科技有限公司。

1.3 細胞與動物

人神經膠質瘤細胞系U87（批號CL-0238）購自武漢益普生物科技有限公司。

SPF 級雄性BALB/c 裸鼠（30 只，5 周齡，體重約20 g）購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK（湘）2019-0017。所有裸鼠均飼養于溫度（23±3）℃、相對濕度（40±10）%、12 h 光照/12 h 黑暗交替的動物房內，自由攝食、飲水。本動物實驗方案獲得河北北方學院附屬第一醫院醫學倫理委員會審核通過（批件號W2022013）。

2 方法

2.1 體外細胞實驗

2.1.1 細胞培養與分組

將U87細胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養，每3 d更換1次培養基。取對數生長期細胞，隨機分為對照組（NC組）、低質量濃度SM組（SM-L組）、中質量濃度SM 組（SM-M 組）、高質量濃度SM 組（SM-H 組）、Akt 激活劑組（SC79 組）、高質量濃度SM 聯合Akt 激活劑組（SM-H+SC79 組）。參考相關文獻[9—10]及前期預實驗結果設置各藥物組質量濃度：SM-L 組、SM-M 組、SM-H組、SC79 組細胞分別用50、100、200 μg/mL 的SM 和20 μmol/L 的SC79 處理48 h；SM-H+SC79 組細胞用200 μg/mL的SM和20 μmol/L的SC79共同處理48 h；NC組細胞不經任何藥物處理，正常培養48 h。

2.1.2 細胞增殖檢測

采用CCK-8 法進行檢測。取對數生長期細胞，按1×104個/孔接種于96 孔板中，按照“2.1.1”項下方法分組（每組設置6 個復孔）、處理。隨后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃下孵育1 h，采用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，用以反映細胞的增殖能力。

2.1.3 細胞克隆形成能力檢測

采用克隆形成實驗進行檢測。取對數生長期細胞，按600 個/孔接種于6 孔板中，按照“2.1.1”項下方法分組（每組設置6 個復孔）、處理后，培養14 d。收集各組細胞，用甲醇固定，再以0.1%結晶紫染色，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，使用顯微鏡觀察其克隆形成情況并計算克隆形成率：細胞克隆形成率＝平均細胞克隆數/每孔接種細胞總數×100%。

2.1.4 細胞凋亡檢測

采用流式細胞術進行檢測。取對數生長期細胞，按1×105個/孔接種于6 孔板中，按照“2.1.1”項下方法分組（每組設置6個復孔）、處理。收集各組細胞，用PBS洗滌后，按Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書方法進行染色，于37 ℃下避光孵育30 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.1.5 細胞中增殖/凋亡相關蛋白和Akt/MAPK 信號通路相關蛋白表達檢測

采用Western blot 法進行檢測。取對數生長期細胞，按1×104個/孔接種于96孔板中，按照“2.1.1”項下方法分組（每組設置6 個復孔）、處理。收集各組細胞，用RIPA裂解液裂解以提取總蛋白。蛋白經定量、電泳、轉膜、封閉后，加入增殖/凋亡相關蛋白（PCNA、Bax、Bcl-2、caspase-3）、Akt/MAPK 信號通路相關蛋白（Akt、p-Akt、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2）、內參蛋白（β-actin）的一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶2 000），于室溫下孵育1.5 h；再次洗膜后，加入ECL 試劑顯色并使用凝膠成像系統成像。使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以PCNA、Bax、Bcl-2、caspase-3 與內參蛋白的灰度值比值表示上述蛋白的表達水平，以p-Akt 與Akt、p-p38 MAPK 與p38 MAPK、p-ERK1/2 與ERK1/2 的灰度值比值分別表示Akt、p38 MAPK、ERK1/2 蛋白的磷酸化水平。

2.2 體內異種移植瘤實驗

取U87細胞懸液（200 μL含細胞1×105個），皮下注射至BALB/c裸鼠的右側腋窩內，當移植瘤體可觸及（約接種后7 d）時，將裸鼠隨機分為對照組（裸鼠NC組）、低劑量SM 組（裸鼠SM-L 組）、中劑量SM 組（裸鼠SM-M組）、高劑量SM 組（裸鼠SM-H 組）、Akt 激活劑組（裸鼠SC79 組）、高劑量SM 聯合Akt 激活劑組（裸鼠SM-H+SC79組），每組5只。參考相關文獻[9，11]及前期預實驗結果設置各藥物組劑量：裸鼠SM-L 組、裸鼠SM-M 組、裸鼠SM-H 組裸鼠分別灌胃25、50、100 mg/kg 的SM，同時腹腔注射等體積生理鹽水；裸鼠SC79 組裸鼠腹腔注射40 mg/kg 的SC79，同時灌胃等體積生理鹽水；裸鼠SMH+SC79 組裸鼠灌胃100 mg/kg 的SM，同時腹腔注射40 mg/kg 的SC79；裸鼠NC 組裸鼠灌胃并腹腔注射等體積生理鹽水，每天1 次，連續28 d。末次給藥24 h 后，以頸椎脫臼處死各組裸鼠，切除瘤體并稱定質量，以游標卡尺測量并計算瘤體體積：瘤體體積＝[0.5×（a+b）]3（式中，a、b分別為腫瘤的長徑、短徑）。

2.3 統計學方法

使用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 體外細胞實驗結果

3.1.1 SM對細胞增殖和克隆形成能力的影響

與NC 組比較，SM-L 組、SM-M 組、SM-H 組細胞的OD 值、克隆形成率均顯著降低且有濃度依賴性（P＜0.05），SC79 組細胞的OD 值、克隆形成率均顯著升高（P＜0.05）；與SM-H 組比較，SM-H+SC79 組細胞的OD值、克隆形成率均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1、圖1。

圖1 各組細胞克隆形成情況比較

表1 各組細胞OD 值、克隆形成率、凋亡率比較（±s，n＝6）

表1 各組細胞OD 值、克隆形成率、凋亡率比較（±s，n＝6）

a：與NC組比較，P＜0.05；b：與SM-L組比較，P＜0.05；c：與SM-M組比較，P＜0.05；d：與SM-H組比較，P＜0.05。

凋亡率/%25.56±1.28 32.28±1.61a 40.46±2.28ab 51.52±2.35abc 14.77±0.69a 33.65±1.78d組別NC組SM-L組SM-M組SM-H組SC79組SM-H+SC79組OD值0.83±0.06 0.71±0.05a 0.62±0.04ab 0.41±0.03abc 0.98±0.08a 0.66±0.07d克隆形成率/%57.78±2.36 50.33±2.17a 41.42±2.05ab 28.35±1.43abc 67.76±3.08a 42.43±2.26d

3.1.2 SM對細胞凋亡的影響

與NC 組比較，SM-L 組、SM-M 組、SM-H 組細胞的凋亡率均顯著升高且有濃度依賴性（P＜0.05），SC79 組細胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與SM-H 組比較，SM-H+SC79組細胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05）。結果見表1、圖2。

圖2 各組細胞凋亡情況比較

3.1.3 SM對細胞中增殖/凋亡相關蛋白表達的影響

與NC 組比較，SM-L 組、SM-M 組、SM-H 組細胞中PCNA、Bcl-2蛋白的表達水平均顯著降低，Bax、caspase-3 蛋白的表達水平均顯著升高，且均有濃度依賴性（P＜0.05）；SC79組細胞中PCNA、Bcl-2蛋白的表達水平均顯著升高，Bax、caspase-3 蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與SM-H 組比較，SM-H+SC79 組細胞中PCNA、Bcl-2 蛋白的表達水平均顯著升高，Bax、caspase-3 蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、表2。

圖3 各組細胞中增殖/凋亡相關蛋白表達的電泳圖

表2 各組細胞中增殖/凋亡相關蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

表2 各組細胞中增殖/凋亡相關蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

a：與NC組比較，P＜0.05；b：與SM-L組比較，P＜0.05；c：與SM-M組比較，P＜0.05；d：與SM-H組比較，P＜0.05。

caspase-3/β-actin 0.47±0.03 0.61±0.05a 0.88±0.07ab 1.16±0.09abc 0.24±0.02a 0.73±0.07d組別NC組SM-L組SM-M組SM-H組SC79組SM-H+SC79組PCNA/β-actin 0.96±0.08 0.83±0.07a 0.65±0.04ab 0.36±0.03abc 1.28±0.11a 0.73±0.07d Bax/β-actin 0.23±0.02 0.37±0.03a 0.59±0.05ab 0.89±0.08abc 0.11±0.01a 0.48±0.04d Bcl-2/β-actin 0.84±0.08 0.72±0.07a 0.61±0.05ab 0.23±0.02abc 1.45±0.16a 0.67±0.06d

3.1.4 SM對細胞中Akt/MAPK信號通路相關蛋白表達的影響

與NC 組比較，SM-L 組、SM-M 組、SM-H 組細胞中Akt、p38 MAPK、ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著降低且有濃度依賴性（P＜0.05），SC79 組細胞中Akt、p38 MAPK、ERK1/2 蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）；與SM-H 組比較，SM-H+SC79 組細胞中Akt、p38 MAPK、ERK1/2 蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖4、表3。

圖4 各組細胞中Akt/MAPK 信號通路相關蛋白表達的電泳圖

表3 各組細胞中Akt/MAPK 信號通路相關蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

表3 各組細胞中Akt/MAPK 信號通路相關蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

a：與NC組比較，P＜0.05；b：與SM-L組比較，P＜0.05；c：與SM-M組比較，P＜0.05；d：與SM-H組比較，P＜0.05。

組別NC組SM-L組SM-M組SM-H組SC79組SM-H+SC79組p-Akt/Akt 0.91±0.07 0.82±0.08a 0.67±0.06ab 0.23±0.02abc 0.98±0.01a 0.69±0.06d p-p38 MAPK/p38 MAPK 0.81±0.08 0.65±0.06a 0.51±0.05ab 0.34±0.03abc 0.93±0.06a 0.57±0.05d（p-ERK1/2）/（ERK1/2）0.72±0.06 0.61±0.05a 0.53±0.04ab 0.11±0.01abc 0.86±0.06a 0.55±0.05d

3.2 體內異種移植瘤實驗結果

與裸鼠NC組比較，裸鼠SM-L組、裸鼠SM-M組、裸鼠SM-H 組裸鼠體內瘤體的質量及體積均顯著降低/減小且有劑量依賴性（P＜0.05），裸鼠SC79 組裸鼠體內瘤體的質量及體積均顯著升高/增大（P＜0.05）；與裸鼠SM-H組比較，裸鼠SM-H+SC79組裸鼠體內腫瘤的質量及體積均顯著升高/增大（P＜0.05）。結果見圖5、表4。

圖5 各組裸鼠體內腫瘤生長情況比較

表4 各組裸鼠體內瘤體質量及體積比較（±s，n＝5）

表4 各組裸鼠體內瘤體質量及體積比較（±s，n＝5）

a：與裸鼠NC組比較，P＜0.05；b：與裸鼠SM-L組比較，P＜0.05；c：與裸鼠SM-M組比較，P＜0.05；d：與裸鼠SM-H組比較，P＜0.05。

瘤體體積/mm3 95.83±4.26 85.42±4.11a 66.67±3.26ab 43.75±2.01abc 108.33±4.83a 77.08±2.86d組別裸鼠NC組裸鼠SM-L組裸鼠SM-M組裸鼠SM-H組裸鼠SC79組裸鼠SM-H+SC79組瘤體質量/g 0.46±0.03 0.41±0.04a 0.32±0.03ab 0.21±0.02abc 0.52±0.04a 0.37±0.03d

4 討論

膠質瘤作為中樞神經系統最重要的原發性腫瘤，有多種亞型。臨床實踐顯示，即使采用了積極的治療策略（放療和術后化療），彌漫性膠質瘤患者生存期短的問題仍未得到解決[12]。可見，為了有效控制惡性腫瘤的進展、擴散、轉移，改善患者的預后，開發新的膠質瘤治療藥物具有重要意義。

SM 是一種黃酮木脂素類活性成分，可通過誘導細胞凋亡來抑制不同腫瘤細胞系的生長。據報道，SM 可誘導子宮內膜癌細胞凋亡，并可抑制肝癌細胞系MHCC97 增殖[13—14]，提示該成分有一定的抗腫瘤作用。研究指出，PCNA 對腫瘤細胞DNA 的復制至關重要，其表達水平越高表明細胞的增殖能力越強[15]。Bax、Bcl-2、caspase-3 可用于評估細胞的凋亡能力：Bax 可單獨形成同源二聚體，從而促進細胞凋亡；Bcl-2、Bax與細胞凋亡密切相關，降低Bcl-2 蛋白表達、增強Bax 蛋白表達，可誘導細胞發生凋亡；此外，Bax能促使細胞色素C釋放并轉移至線粒體，激活caspase-3，而活化的caspase-3 可損傷核內DNA，最終導致細胞凋亡[16]。本研究結果顯示，SM 可濃度依賴性地抑制U87 細胞的增殖和克隆形成，并促進其凋亡；同時，該成分可濃度依賴性地上調細胞中Bax、caspase-3 蛋白的表達，下調PCNA、Bcl-2 蛋白的表達，表明SM對人神經膠質瘤細胞有明顯的抑制作用，有望成為神經膠質瘤治療的候選藥物。此外，本研究還發現，SM 可劑量依賴性地抑制異種移植瘤裸鼠的腫瘤生長，初步證實了SM對神經膠質瘤的體內抑制作用。

Akt/MAPK 信號通路是經典的腫瘤相關信號通路，其異常激活與膠質瘤細胞的惡性行為有關[17]。已有研究指出，激活MAPK 信號通路可增強卵巢癌細胞的增殖、遷移等能力[18]；抑制Akt信號通路活化可抑制胃癌細胞的體外增殖[19]。這表明Akt/MAPK信號通路參與了多種腫瘤的惡性進展。本研究結果顯示，與NC 組比較，SC79 組U87 細胞中Akt、p38 MAPK、ERK1/2 蛋白的磷酸化水平均顯著升高，細胞增殖、克隆形成能力均顯著增強，凋亡能力有所減弱，裸鼠體內瘤體質量及體積均顯著升高/增大，表明Akt/MAPK信號通路參與了U87細胞的增殖、凋亡及裸鼠體內的腫瘤生長過程，與文獻報道結果[18—19]基本一致。此外，本研究還發現，SM可抑制細胞中Akt/MAPK信號通路相關蛋白的表達，且呈劑量依賴性，推測該成分對U87 細胞增殖、凋亡及裸鼠體內腫瘤生長的影響可能與抑制Akt/MAPK信號通路有關。

為了驗證上述作用機制，本研究在高質量濃度/高劑量SM 的基礎上聯合Akt 激活劑SC79 對U87 細胞及移植瘤裸鼠進行干預，結果顯示，SC79 減弱了SM 對細胞增殖、克隆形成及裸鼠體內移植瘤生長的抑制作用，同時也減弱了SM 對細胞凋亡的促進作用，表明SM 可能通過抑制Akt/MAPK信號通路來發揮上述作用。

綜上，SM 可能通過抑制Akt/MAPK 信號通路來促進U87 細胞的凋亡，抑制細胞的增殖、克隆形成及異種移植瘤裸鼠體內腫瘤的生長。但SM對神經膠質瘤的抑制作用可能還涉及其他通路，有待后續進一步研究。