達格列凈在ox-LDL誘導形成的THP-1源性泡沫細胞焦亡中的作用

龔才偉,趙廣建,劉大男,歐航君,趙權威,李 輝

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是動脈血管壁脂質聚積的慢性炎癥性疾病[1],嚴重危害人類健康,是心血管疾病致死、致殘的主要病因。巨噬細胞是AS斑塊的主要組成細胞,既能吞噬脂質形成泡沫細胞,又能分泌多種促炎細胞因子來維持局部炎癥反應,進而導致斑塊的不穩定[2-3]。細胞焦亡是一種與炎癥相關的新型程序性細胞死亡,最初發現于巨噬細胞,其發生機制主要分為依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cystein-containing aspartate-specific protease,Caspase)-1的經典途徑和依賴于Caspase-4/5/11的非經典途徑[4]。研究[5]表明,細胞焦亡在AS的發生和發展中起重要作用。目前,臨床上用于調脂、穩定斑塊的抗AS藥物主要是他汀類藥物,其不良反應多,規律用藥后仍難以有效終止AS的進展。研究[6]已證實,達格列凈(dapagliflozin,DAPA)可減輕AS、減少巨噬細胞的浸潤,并增強斑塊的穩定性,但其作用機制不明。該研究擬通過ox-LDL誘導THP-1源性巨噬細胞構建THP-1源性泡沫細胞焦亡模型,探討DAPA對THP-1源性泡沫細胞焦亡的調控作用,為DAPA用于防治AS及其相關疾病提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞 人急性單核白血病細胞系THP-1細胞購于江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.1.2實驗主要試劑和儀器 RPMI-1640培養基 (產品代碼:L210KJ )、胎牛血清 (貨號:S660JY )購于上海源培生物科技股份有限公司;人源氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL,批號:YB-002)購于廣州奕元公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA,批號:P8139)、達格列凈(dapagliflozin,DAPA,產品編號:SML2804)購于美國Sigma公司;細胞計數法-8(CCK-8) 試劑盒購于上海東仁化學科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,貨號:D8371)、Hoechst 33342/碘化丙啶(ropidium iodide,PI)、油紅O試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;Millex-HV 0.45 μm PVDF膜購于美國Millipore有限公司;核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cystein-containing aspartate-specific protease-1,Cleaved caspase-1)、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、消皮素D(gasdermin-D,GSDMD)氮端片段(GSDMD-N)、白細胞介素(interleukin,IL)-18、IL-1β抗體購于北京博奧森生物技術有限公司;GAPDH抗體購于武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 488)購于美國Abcam公司;NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-1β、IL-18引物由通用生物(安徽)股份有限公司設計并合成;TRIzol RNA提取試劑、RNA逆轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自南京(諾唯贊)生物科技有限公司;倒置生物顯微鏡購于日本Olympus公司;多功能酶標儀購于美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 THP-1為懸浮細胞,將其置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養基的培養瓶中,在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中靜置培養,待細胞密度為2×108/L ～2×109/L時進行傳代,傳代至第3代后進行鋪板,并進行后續藥物干預實驗。

1.2.2THP-1源性巨噬細胞的制備 取對數生長期的THP-1細胞加入含160 nmol/L PMA、10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養液,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h誘導分化為THP-1源性巨噬細胞。

1.2.3THP-1源性泡沫細胞焦亡模型的構建 將獲得的THP-1源性巨噬細胞更換新鮮的含有160 nmol/L PMA、10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養液,加入終濃度為100 μg/ml的ox-LDL,共同孵育24 h,即可成功構建THP-1源性泡沫細胞焦亡模型用于后續實驗。

1.2.4藥物干預和實驗分組 將細胞密度調整為4×106/L鋪于6孔板之后,使用ox-LDL或(和)DAPA對THP-1源性巨噬細胞進行處理,并分為以下3組:① 空白對照(NC)組,正常THP-1細胞培養液培養THP-1源性巨噬細胞24 h;② ox-LDL組,采用終濃度為100 μg/ml的ox-LDL處理THP-1源性巨噬細胞24 h;③ 藥物干預(ox-LDL+DAPA)組,根據1.2.6項中THP-1源性巨噬細胞活性最好的DAPA濃度進行干預實驗,用該濃度DAPA預處理THP-1源性巨噬細胞2 h,再加入ox-LDL(100 μg/ml)后培養細胞24 h。

1.2.5以油紅O法檢測THP-1源性巨噬細胞泡沫化水平 泡沫細胞建模結束后,移除細胞培養基,用PBS洗2次,加油紅O固定液固定30 min;棄去固定液,用PBS冼2次;加入60%異丙醇浸冼30 s;棄去60%異丙醇后加入新配制好的油紅O染色液,浸染20 min;棄去染色液,60%異丙醇漂冼30 s,PBS洗5次;加入Mayer蘇木精染色液,復染核2 min;棄去染液后PBS洗5次;加入油紅O緩沖液1 min后, 棄去油紅O緩沖液;加入PBS液覆蓋細胞并在顯微鏡下觀察,細胞內脂質為紅色,胞核為藍色。

1.2.6CCK-8法檢測DAPA對THP-1源性巨噬細胞活力的影響 將DAPA溶于DMSO,THP-1源性巨噬細胞調整濃度為細胞4×105個/ml懸液,接種于96孔板中每孔100 μl,設5個復孔;分別加入0.2% DMSO和不同濃度的DAPA( 0、1、5、10、50、100、500 μmol/L)預處理2 h,加入100 μg/ml ox-LDL共孵育24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl培養1～4 h,用酶標儀在450 nm波長處測各組的吸光度(absorbance,A)值,計算細胞活力CV。CV=(A實驗組-A空白孔)/(A對照組-A空白孔) ×100%。將濃度為0 μmol/L DAPA組對應的A值設置設為100%,其余各組結果均以此為參考,用百分比表示,以未對細胞產生明顯毒性的最大濃度作為最佳濃度進行下一步的干預實驗。

1.2.7Hoechst 33342/PI雙染檢測THP-1源性泡沫細胞焦亡 選擇6孔板中生長密度為80%～90% THP-1源性泡沫細胞焦亡模型,使用PBS潤洗后,依據Hoechst 33342/PI雙染試劑盒說明書先后加入1 ml細胞染色緩沖液、5 μl Hoechst 33342染色液、5 μl PI染色液,混勻后冰上孵育30 min,再用PBS洗滌1次,置于倒置熒光顯微鏡下檢測熒光,Hoechst 33342為藍色,PI為紅色。

1.2.8THP-1源性泡沫細胞免疫熒光雙染 DAPI(藍色)和Caspase-1(綠色)雙染用于評估DAPA對THP-1源性泡沫細胞焦亡中焦亡關鍵因子Caspase-1表達的影響。首先將THP-1細胞以4×106/L密度鋪于6孔板中,將其誘導為THP-1源性巨噬細胞,在焦亡誘導處理之后,用PBS輕輕潤洗3次,每次5 min;向每個孔中加入適量的4%多聚甲醛溶液,室溫下固定15 min;去掉固定液,加入PBS清洗3次,每次5 min;每個樣本浸于0.5%Triton X-100破膜液中,室溫孵育15 min進行通透處理;其次予10%山羊血清封閉30 min后,吸凈封閉液后,每孔加入適量的Caspase-1一抗4 ℃孵育過夜,次日滴加二抗,37 ℃避光孵育90 min,取出各組細胞爬片,然后用DAPI復染細胞核,避光室溫孵育10 min,最后封片和成像。

1.2.9采用LDH釋放實驗檢測LDH活性 LDH活性能夠有效地反映細胞膜的完整性與否,常用來評估細胞受損程度。根據LDH活性檢測試劑盒的說明書制備細胞樣本、標準品,并將制備的標本轉移至96孔板中,使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔A值并計算細胞中LDH的活性:LDH活性(%)=(A樣品-A對照孔)/(A標準品-A對照孔)×100%。

1.2.10Western blot檢測NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白表達 收集培養的各組細胞,經PBS潤洗后,加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,將裂解物轉移至1.5 ml EP管,于4 ℃,12 000 r/min高速離心10 min,取上清液,加入4倍體積的5×Loading buffer,100 ℃條件下加熱10 min,后采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白上樣,經SDS-PAGE電泳分離,轉膜至PVDF膜上后,采用5%脫脂牛奶室溫下封閉目的條帶2 h,其次用TBST洗膜3次,10 min/次;然后分別加入NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1β單克隆抗體(1 ∶1 000)或GAPDH一抗(1 ∶10 000),4 ℃冰箱搖床孵育過夜,第2天用TBST洗膜3次,10 min/次,之后加入羊抗兔IgG(1 ∶10 000) 室溫搖床孵育2 h,TBST洗膜3次,10 min/次,洗膜后ECL顯影用凝膠圖像處理器分析圖像,GAPDH作為內參照,目的蛋白與其灰度比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.2.11qRT-PCR檢測NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1βmRNA表達 用TRIzol試劑從細胞樣本中提取總RNA,并將其逆轉錄為cDNA。使用SYBR qPCR Master Mix試劑盒檢測qRT-PCR,檢測前述焦亡功能因子和內參GAPDHmRNA的表達。以GAPDH為內參,使用2-ΔΔCt法分析mRNA表達的相對倍數變化。每個樣品的分析重復3次。本實驗所用實時定量PCR目的基因引物序列如表1所示。

表1 實時定量PCR目的基因引物序列

2 結果

2.1 THP-1巨噬細胞的誘導、分化未經PMA誘導分化的THP-1單核細胞呈透亮圓形或類圓形狀態,懸浮狀生長,細胞表面光滑,無偽足(圖1A)。加入PMA誘導分化24 h后則分化為人巨噬細胞,細胞由懸浮狀態變為貼壁狀態,細胞伸出偽足,呈不規則、貼壁狀生長(圖1B)。

圖1 THP-1分化為巨噬細胞 ×200A:THP-1單核細胞;B:THP-1源性巨噬細胞

2.2 CCK-8篩選DAPA的最佳干預濃度THP-1源性巨噬細胞經不同濃度的DAPA干預24 h后,結果如圖2所示,與0 μmol/L組相比,溶劑DMSO (0.2%DMSO)組細胞活性無顯著變化;除DAPA濃度為10 μmol/L時THP-1源性巨噬細胞活性無顯著性變化,其余組隨著DAPA濃度升高,細胞活性出現下降趨勢;其中,濃度為50、100和500 μmol/L時,細胞活性減低(F=31.67,P<0.05)。因此,10 μmol/L DAPA是不影響THP-1源性巨噬細胞活性的最大濃度,可作為DAPA的最佳干預濃度。

圖2 CCK-8檢測DAPA干預對THP-1源性巨噬細胞活性的影響與0 μmol/L DAPA組比較:*P<0.05

2.3 油紅O染色檢測THP-1源性泡沫細胞焦亡模型的構建及DAPA(10 μmol/L)對ox-LDL誘導形成的泡沫細胞泡沫化水平的影響油紅O染色結果顯示,在NC組中,THP-1源性巨噬細胞胞質內幾乎沒有或僅有少量脂質沉積,見圖3A;與NC組比較,ox-LDL組中THP-1源性巨噬細胞胞質內有顯著增多、變大的亮紅色脂滴呈典型泡沫細胞形態,說明THP-1源性泡沫細胞焦亡模型的構建成功,見圖3B;與ox-LDL組比較,ox-LDL+DAPA(10 μmol/L)組中THP-1源性巨噬細胞胞質內紅色脂滴顯著減少、變小,提示泡沫細胞生成的數量明顯減少,見圖3C。說明10 μmol/L的DAPA可有效抑制由ox-LDL誘導的泡沫細胞的形成。

圖3 油紅O染色檢測泡沫細胞焦亡模型的構建及DAPA對泡沫細胞泡沫化水平的影響 ×400A:NC組;B:ox-LDL組;C:ox-LDL+DAPA組

2.4 DAPA對ox-LDL誘導形成的THP-1源性泡沫細胞焦亡的影響

2.4.1qRT-PCR檢測DAPA對ox-LDL誘導形成的泡沫細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18和IL-1βmRNA的表達水平的影響 與NC組相比,ox-LDL組ox-LDL誘導形成的泡沫細胞中焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18和IL-1βmRNA的表達水平均升高(P<0.05),差異有統計學意義;與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組DAPA處理后上述指標水平均降低(P<0.05),差異有統計學意義。見圖4。

圖4 DAPA對各組中NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β mRNA表達水平的影響A:ASC;B:Caspase-1;C:GSDMD;D:IL-1β;E:IL-18;F:NLRP3;與NC組比較:*P<0.05 (n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

2.4.2Western blot檢測DAPA對ox-LDL誘導形成的泡沫細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18和IL-1β蛋白表達水平的影響 與NC組相比,ox-LDL組ox-LDL誘導形成的泡沫細胞中焦亡相關蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18和IL-1β 蛋白的表達水平均升高(P<0.05),差異有統計學意義。與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組DAPA處理后上述指標水平均降低(P<0.05),差異有統計學意義。見圖5。

圖5 Western blot檢測DAPA對各組中NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白表達水平的影響A:灰帶圖;B:ASC;C:Cleaved caspase-1;D:GSDMD-N;E:IL-1β;F:IL-18;G:NLRP3;與NC組比較:*P<0.05(n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

2.4.3Hoechst 33342/PI雙染和LDH釋放試驗評估DAPA對THP-1源性泡沫細胞焦亡的影響 Hoechst 33342/PI雙染結果及LDH釋放試驗顯示,與NC組相比,ox-LDL組中THP-1源性泡沫細胞PI陽性細胞比例升高且LDH活性升高(P<0.05);與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組THP-1源性泡沫細胞PI陽性細胞比例降低(P<0.05)且LDH活性降低。見圖6。

圖6 Hoechst 33342/PI雙染和LDH釋放試驗評估DAPA對THP-1源性泡沫細胞焦亡的影響A:Hoechst 33342/PI雙染 ×100;B:各組PI陽性細胞數比例;C:各組LDH活性比較;與NC組比較:*P<0.05(n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

2.4.4細胞免疫熒光檢測DAPA對泡沫細胞焦亡模型中焦亡關鍵蛋白Caspase-1表達的影響 與NC組相比,ox-LDL組ox-LDL誘導的泡沫細胞焦亡模型中Caspase-1熒光強度(綠色)明顯增強(P<0.05);與ox-LDL組相比,ox-LDL+DAPA組DAPA處理后Caspase-1熒光強度減弱(P<0.05)。以上結果說明DAPA可抑制泡沫細胞焦亡模型中焦亡關鍵蛋白Caspase-1的表達。見圖7。

圖7 細胞免疫熒光檢測DAPA對泡沫細胞焦亡模型中Caspase-1表達的影響A:Caspase-1細胞免疫熒光雙染 ×100;B:各組Caspase-1熒光強度;與NC組比較:*P<0.05 (n=3);與ox-LDL組比較:#P<0.05(n=3)

3 討論

AS是一種進行性病變,是大多數心血管疾病的重要病理基礎,脂質代謝不平衡和不適宜的炎癥反應共同參與了AS病變的進展,其特征是大動脈中脂質和纖維成分的積聚。巨噬細胞浸潤和脂質沉積是粥樣斑塊形成的關鍵步驟,泡沫細胞的形成,被廣泛認為是AS的關鍵驅動因素[3]。ox-LDL是巨噬細胞泡沫化過程中膽固醇的主要來源,血管內膜下的巨噬細胞吞噬大量ox-LDL轉化為泡沫細胞,促進AS斑塊形成[3]。在本研究中,THP-1源性的巨噬細胞用ox-LDL處理后,經油紅O染色,結果如圖3B所示,細胞胞質內有大量紅色脂滴蓄積,細胞體積增大,符合泡沫細胞形態,表明THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞模型構建成功。

DAPA是鈉-葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑(sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors,SGLT2i)成員之一,其通過選擇性地抑制SGLT2來減少腎小管對葡萄糖的重吸收和增加尿糖排出而降低血糖[7]。有研究[8]表明,SGLT2i可通過降低血糖對內皮細胞的“毒性”而發揮抗炎癥和抗氧化潛能進而延緩AS。Terasaki et al[9]發現SGLT2i可抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成,從而發揮抗AS的作用;在本研究中,以DAPA干預ox-LDL誘導的THP-1源性的巨噬細胞后得到了類似的結果:油紅O染色結果顯示,與ox-LDL組相比,DAPA組巨噬細胞胞質內的紅色脂滴明顯減少,細胞體積減小。以上研究說明DAPA能夠抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞形成。

巨噬細胞在AS病變中扮演著重要的角色,巨噬細胞中紊亂的脂質代謝是泡沫細胞產生的主要原因,這些脂質不能清除時,其可誘導巨噬細胞焦亡。細胞焦亡的主要特征之一為由Caspase-1下游的GSDMD家族蛋白介導細胞膜膜孔形成,造成細胞膜的完整性喪失、細胞腫脹、細胞溶解、細胞內的內容物和促炎細胞因子如LDH、IL-18和IL-1β釋放到細胞外。因此,檢測上清液中的LDH活性可反應細胞的活性情況,檢測細胞IL-18和IL-1β的蛋白表達情況可反應炎癥情況。既往多項研究[10-11]表明,ox-LDL和膽固醇晶體均能誘導巨噬細胞NLRP3炎癥小體的形成并激活Caspase-1,刺激IL-Iβ和IL-18的表達。Xu et al[12]研究表明,在晚期的AS斑塊中,巨噬細胞焦亡促進壞死核心的形成和斑塊的不穩定,進而誘發急性心血管事件發生。在冠狀AS斑塊中,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-Iβ和IL-18表達明顯增高[13]。NLRP3抑制劑可抑制AS小鼠中巨噬細胞焦亡,下調AS小鼠中巨噬細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達[14]。因此,通過抑制巨噬細胞焦亡可能延緩AS的發生和發展。DAPA是國內第一個上市的SGLT2i降糖藥,研究[15]表明,DAPA能抑制糖尿病ApoE-/-小鼠中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達。Liu et al[6]研究中提到,SGLT2i可通過抑制血管炎癥、減輕氧化應激和減少泡沫細胞形成等機制改善AS的進展。在本研究中,通過ox-LDL刺激巨噬細胞后顯示,THP-1源性泡沫細胞中NLRP3、Cleavedcaspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-18、IL-1βmRNA和蛋白表達水平均明顯升高,PI陽性細胞數及LDH活性明顯增加,予以DAPA干預后,上述焦亡相關蛋白的mRNA和蛋白表達水平、PI陽性細胞數及LDH活性均被明顯抑制;細胞免疫熒光結果顯示,ox-LDL刺激巨噬細胞后,Caspase-1的熒光強度明顯增強,予以DAPA干預后,熒光強度明顯減弱。這些結果說明了DAPA抑制了THP-1源性泡沫細胞焦亡。

綜上所述,DAPA能有效抑制NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β的表達,進而抑制了THP-1源性泡沫細胞焦亡,并能抑制泡沫細胞的形成。該研究僅從細胞層面驗證了DAPA抑制泡沫細胞焦亡的作用,下一步擬進行動物實驗研究,為DAPA用于防治AS提供更多的理論依據。