解凍復蘇囊胚行植入前遺傳學檢測臨床結局分析

匡 丹,郝 燕,陳大蔚,章志國,張 清,尹奕琪,王 凝,周 平,魏兆蓮,曹云霞

常規植入前遺傳學檢測技術(preimplantation genetic testing,PGT)中尚有一定比例的胚胎無法得到明確診斷,胚胎不能診斷率在不同的文獻報道有所不同[1]。未獲診斷的胚胎若含有正常胚胎則可能在一定程度上造成了胚胎的“浪費”。但對未獲診斷的胚胎行再次PGT,胚胎會多經歷一次冷凍和活檢過程,即“二次冷凍、二次活檢(double frozen double biopsy,DFDB)”。此外,對于移植常規體外受精周期胚胎出現不良妊娠結局或者之后查出有遺傳缺陷的患者會要求對剩余冷凍的胚胎進行解凍復蘇后活檢,活檢后的囊胚會再次冷凍等待遺傳學結果,這些胚胎與常規PGT胚胎相比,多經歷一次冷凍解凍復蘇過程,即“二次冷凍、一次活檢(double frozen single biopsy,DFSB)”。操作是否會影響囊胚的種植潛能有待進一步研究,可供參考的數據非常有限[2-5]。

該研究主要分析DFDB和DFSB胚胎PGT的臨床結局相關資料,為解凍復蘇胚胎PGT安全性問題提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性分析2020年8月—2022年7月安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心24例DFDB病例和14例DFSB病例。24例行DFDB患者因常規PGT周期無正常可移植囊胚或移植正常囊胚未獲妊娠,選擇對未獲診斷的囊胚行解凍后再次活檢。14例DFSB患者因移植常規ICSI周期胚胎,出現反復流產、反復種植失敗或出生子代為單基因病患者,這14對夫婦選擇對剩余冷凍保存的囊胚行解凍后活檢。

1.1.1DFDB組 共納入24例患者,女方年齡為25～42(30.67±4.45)歲,體質量指數(body mass index,BMI)為(21.89±2.69),促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)為(8.15±2.66)IU/L。男方年齡24～42(31.38±4.52)歲。這24例患者中有16例男方或者女方染色體異常,有4例為單基因病(ADPKD 2例,Joubert綜合征1例,家族性多發性內分泌瘤病1例),余4例為反復流產或者反復種植失敗患者。

1.1.2DFSB組 共納入14例患者,女方年齡24～42(30.79±5.73)歲,BMI為(22.72±3.91),FSH為(7.58±2.10) IU/L。男方年齡25～44(31.36±5.05)歲。這14例患者解凍移植常規卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)周期胚胎,均出現不良妊娠結局:其中有11例移植后有反復流產和反復種植失敗史,還有2例(病例30和病例37)移植ICSI胚胎后出生的嬰兒發育異常,遂對患兒行基因檢測,為單基因病(均為X連鎖遺傳病),女方分別為KAT6A基因突變和FMR1基因前突變攜帶者,有PGT指征,故再生育時擬對ICSI剩余冷凍胚胎行PGT。病例8男方之后查出Y染色體微缺失,因ICSI周期活產嬰兒性別為男性,再生育時行囊胚解凍后的PGT(性別選擇女胚+染色體非整倍體篩查)。該研究的開展已獲得安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準,倫理批號是2017002。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1控制性超促排卵、取卵、受精和胚胎培養 采用中心常規促排方案進行超促排卵,當陰道超聲監測優勢卵泡有1個直徑≥18 mm或2個直徑≥17 mm或3個直徑≥16 mm時,注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)10 000 IU或艾澤250 μg,36 h后在陰道超聲引導下行經陰道后穹窿穿刺取卵,取卵后4～6 h 行ICSI,后將胚胎轉入胚胎培養液培養至第5天或第6天囊胚階段,囊胚質量的評級采用Gardner評分標準。HCG購于珠海麗珠公司,艾澤購于德國默克雪蘭諾公司,胚胎培養液購于澳大利亞COOK公司。

1.2.2胚胎冷凍和活檢

1.2.2.1DFDB組 培養至第5日或第6日的評級為4CC級別以上囊胚,用活檢針吸取6～10個滋養層細胞(trophoblast cell, TE),活檢后的囊胚行玻璃化冷凍。活檢后的TE用拉制好的巴斯德管轉移至含有2 μl PBS的0.2 ml PCR管中,全基因組擴增后利用高通量測序技術(next-generation sequencing,NGS)行染色體拷貝數分析。如果是單基因病,進入取卵周期前,需構建家系有效單核苷酸多態性(SNP)位點,行家系SNP單體型預實驗,主要過程包括:引物設計、DNA純化、建庫和NGS。預實驗通過的有效單體型可用于判斷胚胎是否攜帶目標基因突變。對于SNP單體型分析正常的囊胚再行染色體拷貝數分析。對于周期中未明確診斷的囊胚,解凍后予以再次活檢,活檢后的囊胚行再次玻璃化冷凍。

1.2.2.2DFSB組 培養至第5天或第6天的評級為4CC級別以上囊胚行玻璃化冷凍。因解凍移植該周期胚胎后有反復流產和反復種植失敗史以及出生單基因病患兒,擬對ICSI剩余冷凍胚胎行PGT。囊胚解凍后行TE活檢,活檢后的囊胚行再次玻璃化冷凍。活檢后的TE用拉制好的巴斯德管轉移至含有2 μl PBS的0.2 ml PCR管中,全基因組擴增后利用NGS行遺傳學分析,具體步驟與DFDB組相同。

1.3 胚胎解凍與移植對于月經周期規律的患者,采用自然周期方案,對于月經周期不規律的患者,采用人工周期方案。解凍DFDB和DFSB組NGS檢測結果正常的囊胚,移植入子宮內。臨床妊娠定義為移植胚胎35 d后陰道超聲顯示宮腔內可見孕囊。

2 結果

2.1 DFDB病例

2.1.1上個PGT周期促排方案和取卵、受精以及囊胚形成情況 24例患者中有11例患者使用常規長方案超促排卵,另外的13例患者使用拮抗劑方案促排卵,促性腺激素(gonadotropins,Gn)用量為(2 337.50±727.49)IU,Gn時間為(10.25±1.85)d(表1)。上個PGT周期共獲卵377枚,其中成熟卵子294枚,受精260枚,卵裂250枚,獲得第5天或第6天囊胚139枚,卵子成熟率為77.98%(294/377),受精率為88.44%(260/294),卵裂率為96.15%(250/260),囊胚率為55.60%(139/250),見表2。

表1 DFDB組和DFSB組患者基本臨床信息

表2 DFDB組上個PGT周期胚胎體外受精、卵裂及活檢診斷情況(n)

2.1.2囊胚解凍和活檢結果 納入研究的24例患者共行24個PGT周期,這24個周期均含未獲診斷的囊胚。24個PGT周期共活檢135枚囊胚,其中診斷正常/平衡的囊胚一共是8枚,診斷異常的囊胚數一共是82枚,嵌合的囊胚數為11枚,未獲診斷的囊胚數為34枚,各型囊胚所占比例分別為5.93%(8/135)、60.74%(82/135)、8.15%(11/135)、25.19%(34/135)(表2)。有34枚未被明確診斷的胚胎中,包含優質囊胚10枚,非優質囊胚24枚,非優質囊胚占比70.59%。本中心同時期活檢的總胚胎數至少為 1 200 枚,總體胚胎不能診斷率大約為2.83%。

這24例患者因在PGT周期無正常可移植囊胚或者因移植正常或者嵌合囊胚未獲得成功妊娠,要求對剩余未獲診斷的囊胚解凍后行二次活檢,等待遺傳學檢測結果擇期移植。一共解凍34枚囊胚,其中存活32枚,解凍后囊胚存活率為94.12%。這32枚囊胚在解凍二次活檢后,行遺傳學檢測,均獲得明確診斷。其中診斷正常的囊胚一共是15枚,診斷異常的囊胚數一共是17枚,所占比例分別為46.88%(15/32)和53.13%(17/32),嵌合的囊胚數和未獲診斷的囊胚數目均為0。見表3。

表3 DFDB組二次活檢胚胎診斷情況和臨床妊娠結局(n)

2.1.3臨床妊娠結局 24例行DFDB的患者,有13例患者無正常胚胎可供移植,剩余的11例患者目前已移植8例,共移植9枚胚胎(其中1名患者移植兩次),移植患者的胚胎解凍后均存活并擴張。移植患者平均年齡分別為(31.5±4.57)歲,其中有5例臨床妊娠,3例未孕,臨床妊娠率為62.5%(表3)。臨床妊娠的5例患者,有1例已足月剖宮產1健康女嬰(病例6,女方年齡27歲),體質量3 300 g,身長50 cm,發育良好,無妊娠合并癥發生。還有4例繼續妊娠中,均為單胎。

2.2 DFSB病例

2.2.1上個周期促排方案和取卵、受精以及囊胚形成情況 納入的14例患者中有9例患者使用長方案促排卵,5例患者使用拮抗劑方案促排卵,平均Gn用量為(2 273.21±686.49) IU,平均Gn時間為(11.21±2.64)d(表1)。新鮮ICSI周期共獲卵231枚,其中成熟卵子200枚,受精192枚,卵裂173枚,獲第5天或第6天囊胚102枚,卵子成熟率為86.58%(200/231),受精率為96.00%(192/200),卵裂率為90.10%(173/192),囊胚率為59.00%(102/173)。見表4。

2.2.2囊胚解凍和活檢結果 這14例患者解凍移植常規ICSI周期胚胎,均出現不良妊娠結局,要求對剩余囊胚行活檢檢測。一共解凍復蘇ICSI周期剩余的50枚囊胚,50枚囊胚解凍后均存活。活檢這50枚囊胚,活檢后的TE經過全基因組擴增,再進行遺傳學分析,47枚囊胚診斷明確,其中診斷正常/平衡的囊胚一共是9枚,診斷異常的囊胚數一共是28枚,嵌合的囊胚數為10枚,未獲診斷的囊胚數為3枚(4BC、4BB和3BB級別囊胚),所占比例分別為18.00%(9/50),56.00%(28/50),20.00%(10/50),6.00%(3/50)。見表4。

2.2.3臨床妊娠結局 14例行DFSB患者中有4例患者既無正常胚胎也無嵌合體胚胎可供移植,剩余的10例患者目前已移植5例,共移植5枚胚胎,移植患者的胚胎解凍后均存活并擴張。移植患者的平均年齡為(32.6±6.47)歲,3例臨床妊娠,2例未孕,臨床妊娠率為60%(表4)。臨床妊娠的3例患者,有1例足月剖宮產1健康男嬰(病例28,女方年齡42歲),體質量3 050 g,身長50 cm,發育良好,無妊娠合并癥發生;有2例繼續妊娠中,均為單胎。

2.3 2組結果統計學比較DFDB組和DFSB組女方年齡、男方年齡、BMI、Gn用量和天數比較采用兩獨立樣本的t檢驗或Mann-Whitney非參數檢驗,差異均無統計學意義。DFDB組和DFSB組囊胚復蘇率分別為94.12%和100%,臨床妊娠率分別為62.5%和60%。采用χ2檢驗對兩組復蘇率和妊娠率進行比較,差異無統計學意義。

3 討論

目前,國內外大多數中心PGT過程多采用囊胚活檢的方式,活檢后囊胚行玻璃化冷凍。這兩項技術也被認為是安全有效的。然而,在一些病例當中,需要進行DFDB或DFSB的操作。這些胚胎的臨床結局如何,目前報道的并不多。本研究主要分析了PGT周期和DFDB以及DFSB胚胎的解凍復蘇效果和PGT臨床妊娠結局。

胚胎不能被診斷是PGT過程中經常面臨的問題,而這些胚胎的再診斷對于患者的意義重大,特別是對于高齡患者。本研究中,采用NGS方法對這些未獲診斷的胚胎進行診斷,均診斷明確。DFDB組在上個PGT周期中未被診斷的胚胎比例大約為2.83%,DFSB組未獲診斷胚胎比例約為6%,這與文獻報道的(2%～6%)[1,3-4,6-7]基本類似,在可控范圍之內。

胚胎不能被診斷的原因有很多,囊胚TE質量差是導致胚胎不能診斷的主要原因[3-8]。因為囊胚TE中,會有7%～8%的細胞發生凋亡,對于質量差的囊胚,這一比例會上升到27%,因此,活檢這部分質量差囊胚會導致凋亡的TE細胞比例上升從而影響活檢細胞的質量。此外,活檢過程中激光打孔和切割可能會損傷細胞核,進而影響到活檢TE細胞質量從而導致無法診斷。但Cimadomo et al[1]研究表明PGT胚胎未診斷率與胚胎質量無關,與活檢細胞的數量有關(從第6天完全擴張的囊胚中活檢8個細胞是比較合適的)。由于活檢的細胞數量是可控的,所以他們認為胚胎不能被診斷是操作技術層面的問題,而與患者年齡、PGT指征等無關。

本研究中DFDB組上個PGT周期未獲診斷的34枚囊胚中,非優質囊胚占比70.59%,DFSB組未獲診斷的囊胚數為3枚,含1枚非優質囊胚。本研究活檢細胞的數量平均在6～10個,一些TE相對“致密”或者“纖維化”的囊胚,活檢難度增加,激光切割時間較長,“熱效應”可能損傷一部分細胞,導致有效細胞數量下降,也可能是本研究中胚胎未獲診斷的原因之一。對于DFDB組和DFSB組囊胚,均采用在解凍囊胚培養擴張后再行活檢,此方法的目的主要為了評估囊胚的擴張程度從而間接評價囊胚質量。采用該方法,DFDB組囊胚均獲得明確診斷,DFSB組診斷率也可達到94%。所以,傾向于認為囊胚質量是影響PGT診斷率的因素之一。

DFDB組,診斷正常的囊胚為46.88%,與文獻報道的44%～67%[1-3,9]類似。DFSB組,經PGT診斷正常的囊胚占比為18.00%,雖然低于文獻的報道,但是還有20%的嵌合體囊胚,這些嵌合體囊胚也可作為移植候選胚胎[10]。移植后,DFDB組和DFSB組分別妊娠4例和3例。這一數據顯示DFDB和DFSB均有應用的臨床價值。

常規PGT胚胎解凍復蘇率大約為98.4%[2],二次解凍囊胚復蘇率被報道的在87.5%～100%之間[1-3,9]。本研究中DFDB組和DFSB組第一次囊胚解凍復蘇存活率分別為94.12%和100%,兩組移植患者的胚胎解凍后均存活并擴張,與文獻報道的基本類似。雖然DFDB組第一次囊胚解凍復蘇存活率低于DFSB組,但差異不顯著。本研究結果表明:囊胚基本可以耐受兩輪玻璃化冷凍。DFDB似乎并沒有降低囊胚的復蘇率,顯示了囊胚良好的“抗壓能力”。

Ding et al[5]將常規PGT組為對照組,認為DFSB檢測不會影響胚胎質量或PGT臨床結果。Cimadomo et al[1]研究中,把DFDB作為病例組,常規DFSB作為對照組,發現臨床妊娠率和活產率無差異,這些數據說明DFDB并沒有降低囊胚種植潛能。但也有學者認為[4,11]DFDB會損傷囊胚的存活力。本研究中DFDB組囊胚解凍復蘇存活率略低于DFSB組,但由于樣本量較小,并沒有統計學意義,所以需要擴大樣本量進行研究。本研究中DFDB組和DFSB組的臨床妊娠率分別達到62.5%和60%,與安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心常規PGT臨床妊娠率相當,充分說明了這些囊胚的臨床應用價值。

本研究中,對于冷凍解凍胚胎的PGT作了明確區分,不僅僅只是分析了上個PGT周期診斷失敗的胚胎。DFDB組和DFSB組分別涉及囊胚二次活檢和一次活檢操作。雖然囊胚滋養層活檢已被證明比卵裂期活檢侵入性小[11],但它對于產科結局和新生兒健康隨訪的相關報道并不多[12-13]。在一項小樣本規模的隊列研究中,與囊胚滋養層活檢相關的先兆子癇風險增加[11],但在另一項針對1 721例兒童的回顧性隊列研究中,囊胚滋養層活檢與對照組相比不會增加新生兒結局的任何額外風險[12]。本研究中,DFDB組和DFSB組分別足月產1例嬰兒,均無妊娠期并發癥發生,嬰兒隨訪至今均健康。

總之,該研究表明,DFDB及DFSB組均可獲得可接受的妊娠率,有其應用的臨床價值。但是由于該研究樣本量較小,故還需要多中心的、大樣本量和更加嚴格的科研設計研究用以評估其安全性。