口腔鱗狀細(xì)胞癌中IGF1的表達(dá)及其臨床意義

曾 潔,祖木熱提古麗·阿不來提,馬琰迪,俞雪燕,夏飛飛,徐 江

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)約占口腔癌的90%,是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球健康問題,到目前為止,盡管對(duì)OSCC的手術(shù)方法和輔助治療不斷改進(jìn),但5年生存率沒有顯著增加[1- 2]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (insulin like growth factor 1,IGF1) 是一種多效性因子,可循環(huán)至全身各處,由70多個(gè)氨基酸組成[3],其結(jié)構(gòu)類似于人類胰島素原,是多種正常和惡性細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)因子[4]。IGF1的表達(dá)與多種腫瘤相關(guān),如結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的增加被認(rèn)為是由IGF1的增殖作用引起[5]。該實(shí)驗(yàn)將采用免疫組織化學(xué)Envision法,測(cè)定在OSCC和鄰近正常組織中IGF1的表達(dá)情況,分析IGF1表達(dá)與OSCC臨床特性和預(yù)后之間的關(guān)系,并從細(xì)胞水平進(jìn)一步檢測(cè)其表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞系115份OSCC組織樣本(OSCC組)及74份正常組織樣本(正常組)(距離癌組織2 cm以上)均來自石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院2004—2019年間確診的OSCC患者,由2位高年資病理醫(yī)師對(duì)標(biāo)本進(jìn)行診斷并制作成組織芯片,收集相對(duì)應(yīng)的基本病理信息及臨床資料,通過電話、醫(yī)院病歷或其他方法等,在115例OSCC患者中隨訪70例。本研究經(jīng)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):A2021-073-01)。

本研究中使用了1種人口腔角質(zhì)細(xì)胞株(HOK)和4種OSCC細(xì)胞系(CAL-27、TCA8113、SCC-15、SCC-25),其中HOK購(gòu)自北京北納生物科技有限公司,CAL-27、SCC-15購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫,SCC-25、TCA8113細(xì)胞購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。

1.2 主要儀器與試劑細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、-80 ℃冰箱購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)Bio-rad公司;蛋白成像儀購(gòu)于上海天能公司;熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Agilent公司。兔抗IGF1單克隆抗體(ab263903)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司;GAPDH抗體(K200057M)、青鏈霉素混合液(P1400)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)、免疫組化試劑盒(PV-6001)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、血清購(gòu)于以色列BI公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CW2582)、qRT-PCR試劑盒(CW2623)購(gòu)于江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組織化學(xué) 選取Envision二步法進(jìn)行實(shí)驗(yàn):切取經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋的4 μm組織切片,將組織切片依次在二甲苯、乙醇中脫蠟水化,室溫下用3%H2O2封閉10 min后洗滌,然后將所有切片與IGF1一抗(1 ∶500)在4 ℃孵育過夜,繼而與二抗孵育,PBS沖洗后DAB顯色,蘇木精核染色后封片,顯微鏡下閱片。

結(jié)果判定:以呈棕黃色顆粒為陽性,IGF1染色總得分=著色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比;為了便于統(tǒng)計(jì)分析,以<7為低表達(dá),≥ 7為高表達(dá)[6],見表1。

表1 免疫組化結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot) 收集HOK、CAL-27、TCA-8113、SCC-15和SCC-25五種細(xì)胞,用RIPA裂解液分離總蛋白,蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,用稀釋的一抗(IGF1,1 ∶1 000; GAPDH,1 ∶5 000)4 ℃下孵育過夜。隔天用含0.2%吐溫(TBST)的TBS洗滌6次,每次5 min,后將膜與二抗[山羊抗兔IgG(H+L)-HRP,1 ∶15 000]靜孵2 h,再次洗膜,蛋白成像儀檢測(cè)蛋白條帶, Image J 進(jìn)行蛋白半定量,分析IGF1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 收集HOK、CAL-27、TCA-8113、SCC-15和SCC-25五種細(xì)胞,按照TRIzol 試劑說明提取總RNA,檢測(cè)RNA濃度,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用特異性引物擴(kuò)增IGF1和GAPDH,引物序列見表2,以 GAPDH 基因 mRNA 表達(dá)水平為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,采用2-ΔΔCt法計(jì)算上述五種細(xì)胞中的IGF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 目的基因引物設(shè)計(jì)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 9.0軟件

進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用χ2檢驗(yàn)比較OSCC組織中IGF1的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性,存在個(gè)別數(shù)值的理論頻數(shù)小于5時(shí),以連續(xù)校正值為χ2檢驗(yàn)結(jié)果。使用ROC曲線評(píng)估IGF1的表達(dá)高低,從而預(yù)測(cè)OSCC的免疫組化評(píng)分診斷價(jià)值。采用Kaplan-Meier法分析IGF1表達(dá)對(duì)OSCC患者的生存影響,并繪制生存曲線,生存資料中不同變量的風(fēng)險(xiǎn)比采用 COX 回歸分析。計(jì)量資料采用表示,應(yīng)用t檢驗(yàn)對(duì)不同細(xì)胞系蛋白及mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)之間的差異進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF1在OSCC及正常組織中的表達(dá)IGF1主要定位于細(xì)胞膜,少量定位于細(xì)胞質(zhì),在OSCC組和正常組組織中均能觀察到IGF1,但是IGF1在OSCC組中的高表達(dá)率為72.17%,在正常組中是2.70%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表3和圖1。IGF1在OSCC及正常組評(píng)分等級(jí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4和圖2。

圖1 IGF1在不同組織中的表達(dá)A:IGF1 在正常組中低表達(dá)情況;B:IGF1在OSCC組中高表達(dá)情況;1:×40;2:×200;3:×400

圖2 IGF1在不同組織中的表達(dá)

表3 OSCC組及正常組中IGF1的表達(dá)[n(%)]

表4 OSCC組及正常組中IGF1的表達(dá)差異[n(%)]

2.2 IGF1在OSCC組織中的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)IGF1的表達(dá)與分化程度、T分期、浸潤(rùn)深度有相關(guān)性(P<0.05),與年齡、性別、N分期、TNM分期、吸煙、飲酒、HPV感染無相關(guān)性(P>0.05),見表5。

表5 IGF1表達(dá)與OSCC臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)[n(%)]

2.3 IGF1表達(dá)與OSCC的ROC曲線分析在本實(shí)驗(yàn)中,使用ROC曲線分析IGF1在OSCC及對(duì)照組中免疫組化評(píng)分的診斷價(jià)值,結(jié)果表明IGF1在OSCC的表達(dá)曲線下AUC值為0.81,95%CI:0.75～0.87,用診斷臨界值確定OSCC的靈敏度和特異性,靈敏度為0.73,特異性為0.82(診斷臨界點(diǎn)為5),見圖3。

圖3 ROC曲線分析IGF1在OSCC及對(duì)照組中免疫組化評(píng)分

2.4 IGF1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線對(duì)比OSCC中IGF1表達(dá)和患者預(yù)后的關(guān)系,高表達(dá)IGF1的OSCC患者生存時(shí)間較低表達(dá)患者縮短(P=0.03),見圖4。COX單因素分析顯示OSCC中IGF1表達(dá)量(HR=0.37,P=0.006)和分化程度(HR=1.87,P=0.04)和T分期(HR=2.04,P=0.03)和浸潤(rùn)深度(HR=1.94,P=0.04)是影響OSCC患者生存的重要因素,COX多因素生存分析表明IGF1高表達(dá)(HR=0.39,P=0.01)與死亡有關(guān),是影響OSCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素,見表6。

圖4 IGF1表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的生存分析

表6 COX單因素及多因素分析

2.5 IGF1在口腔鱗癌細(xì)胞系中高表達(dá)為了進(jìn)一步確定IGF1的表達(dá),使用Western blot檢測(cè)了一組人類OSCC細(xì)胞系中的IGF1水平,其結(jié)果顯示,OSCC細(xì)胞系與正常口腔上皮細(xì)胞HOK對(duì)比,IGF1蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),見圖5。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IGF1在OSCC細(xì)胞系與HOK相比,mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05),見圖6。

圖5 IGF1在OSCC細(xì)胞系及口腔正常上皮細(xì)胞中的蛋白表達(dá)1:HOK;2:CAL-27;3:Tca-8113;4:SCC-15;5:SCC-25;與HOK比較:**P<0.01,***P<0.001

圖6 IGF1在OSCC細(xì)胞系及口腔正常上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)1:HOK;2:CAL-27;3:Tca-8113;4:SCC-15;5:SCC-25;與HOK比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

OSCC常起源于口腔上皮細(xì)胞逐漸發(fā)展為腫瘤,對(duì)患者的面容、功能和生存質(zhì)量有嚴(yán)重影響[7],了解和發(fā)現(xiàn)新的臨床生物標(biāo)志物,對(duì)改善患者的預(yù)后分層及優(yōu)化抗癌治療有重要的研究?jī)r(jià)值。

IGF1在許多細(xì)胞類型的有絲分裂途徑中起關(guān)鍵作用[8],被認(rèn)為是一種細(xì)胞周期進(jìn)展因子,參與大多數(shù)器官和組織的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和分化以及多種病理情況[9],除此之外,在腫瘤微環(huán)境中,IGF1能夠驅(qū)動(dòng)遷移、侵襲和增殖,促進(jìn)血管生成并維持癌癥干性[10]。腫瘤中 IGF1信號(hào)通路的改變已被廣泛研究,循環(huán)IGF1水平確實(shí)與腫瘤進(jìn)展無關(guān),但腫瘤產(chǎn)生的局部IGF1和胰島素生長(zhǎng)因子受體(IGF1R)表達(dá)對(duì)疾病預(yù)后產(chǎn)生不利影響[11]。本研究免疫組化定性檢查結(jié)果顯示,IGF1主要表達(dá)在細(xì)胞膜,與正常組相比,OSCC組中IGF1過表達(dá)(P<0.001),但癌組織并不完全等同于細(xì)胞系,單一細(xì)胞通過反復(fù)傳代等也可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化;Western blot半定量實(shí)驗(yàn)顯示IGF1在OSCC細(xì)胞系中也高表達(dá),提示IGF1可能參與并促進(jìn)OSCC的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示IGF1的mRNA在腫瘤細(xì)胞中同樣高表達(dá),提示IGF1很有可能作為癌基因在OSCC中發(fā)揮作用。另外,IGF1高表達(dá)還與一些臨床特征密切相關(guān),Aslan et al[12]發(fā)現(xiàn)IGF1在結(jié)腸癌中高表達(dá),并與腫瘤位置和性別相關(guān),Li et al[13]發(fā)現(xiàn)IGF1在卵巢癌中的表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān),且IGF1的表達(dá)越高,卵巢癌患者的生存率越低。本研究顯示IGF1的表達(dá)水平與T分期、浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05),提示IGF1高表達(dá)與 OSCC患者較高的腫瘤侵襲性有關(guān)。此外,IGF1的表達(dá)和分化程度相關(guān)(P<0.05),隨著腫瘤組織的分化程度降低,OSCC組織中IGF1的表達(dá)水平在增加,提示表達(dá)水平與OSCC患者病情程度有關(guān),因此推測(cè)IGF1可能參與了OSCC的癌變過程。采用受試者工作特征ROC曲線分析,將OSCC病例與相鄰正常組織進(jìn)行區(qū)分,IGF1的曲線下面積AUC值為0.81,并確定最佳臨界點(diǎn),特異性是82%,敏感性為73%,可以認(rèn)為IGF1對(duì)OSCC患者具有良好的診斷效力。進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析IGF1蛋白對(duì)OSCC患者預(yù)后的臨床價(jià)值,應(yīng)用Kaplan-Meier 生存曲線對(duì)患者進(jìn)行生存分析,高表達(dá)的IGF1與OSCC患者較差的整體生存率相關(guān)(P=0.03),提示預(yù)后不佳;相似的,在軟骨肉瘤中IGF1的表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)[14]。同時(shí)對(duì)影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行COX回歸分析,單因素分析顯示,IGF1表達(dá)量、分化程度、T分期和浸潤(rùn)深淺均是影響OSCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素;多因素分析顯示,IGF1表達(dá)量是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素,且IGF1表達(dá)越高,患者預(yù)后越差。以上研究表明,IGF1高表達(dá)與患者的生存率呈負(fù)相關(guān),可以作為判斷OSCC預(yù)后的指標(biāo)。