TIMP-1在大鼠不可復性牙髓炎中的抗炎作用

唐 穎,李午麗,楊 琪,王 璐,李 頌

活髓保存治療(vital pulp therapy,VPT)是在深齲露髓診斷為不可復性牙髓炎的成熟恒牙中的應用,目前已有大量的臨床研究,但缺乏組織學研究來觀察治療后牙髓炎癥狀態的轉變。在炎癥發展過程中,炎癥遞質介導了組織的損傷、炎性滲出等反應,其中基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)在牙髓炎中起著至關重要的作用[1]。MMP-9可以降解破壞細胞外基質,金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloprotease,TIMP-1)是MMP-9的天然抑制劑,可以通過與MMP-9形成抑制性復合物來防止細胞外基質分解[2]。研究顯示牙髓炎癥期間牙髓中的MMP-9含量隨著炎癥進展升高,同時TIMP-1的含量會隨著牙髓炎癥的進展而降低,說明TIMP-1與牙髓炎的發展存在一定的相關性[3],并且TIMP-1可以誘導大鼠健康牙髓形成修復性牙本質[4],但是健康牙髓模型不能反映炎癥牙髓的組織病理學狀態。該研究建立實驗性大鼠不可復性牙髓炎模型,在活髓切斷術中應用TIMP-1,旨在探討TIMP-1在牙髓炎中的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物72只8～10周齡成年雄性SD大鼠,SPF級,300 g±50 g,口腔衛生狀況良好,無齲病及牙周疾病。研究通過安徽醫科大學實驗動物倫理委員會的倫理審查(編號:LLSC20221248)。

1.2 主要材料與儀器光學顯微鏡(型號:Nikon Eclipse E100)購于日本尼康公司;移動式牙科治療機(型號:PC2930)購于廣州市廣州超盛醫療器械有限公司;高速渦輪手機(型號:T3 Racer Midwest)購于德國西諾德公司;根管口探針(型號:DG-16)購于美國登士柏公司;高速鎢鋼車針球鉆(型號:BR-49)購于日本MANI公司;碘伏消毒液(貨號:3180132)購于深圳市安多福消毒高科技股份有限公司;生理鹽水(貨號:R00641)購于成都市四川科倫藥業股份有限公司;TIMP-1(貨號:410-01)購于美國PeproTech公司;玻璃離子水門汀(貨號:56633)購于美國3M公司;一抗CD68(貨號:GB113109)購于武漢塞維爾生物科技有限公司;二抗CY3山羊抗rab(貨號:GB21303)購于武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 不可復性牙髓炎模型的建立大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg),取仰臥位固定于操作臺上,0.5%碘伏消毒口腔及口周后,使用高速渦輪手機及BR-49球鉆在水冷卻下于大鼠雙側上頜第一磨牙咬牙合面中央窩鉆磨,注意要間斷磨除防止產熱過多或意外穿髓,直至窩洞底牙本質透紅,DG16探針略微加壓穿透髓室頂,見出血點,即為穿髓成功。每個磨牙窩洞的制備均使用全新及同一批次的BR-49球鉆以及DG16探針。根據開髓后髓腔開放不同時間分為6、12、24、36、48、72 h組,每組4只共24只大鼠。取上頜骨,分為左右兩半,4%多聚甲醛外固定48 h,組織切片HE染色。分析觀察牙髓炎模型的HE切片,選取出具有典型不可復性牙髓炎組織病理學特點且炎癥局限于冠部的髓腔開放時長——髓腔開放24、36、48 h,后續的實驗在此基礎上進行。

1.4 不可復性牙髓炎的炎癥牙髓切除髓腔開放24、36、48 h誘導不可復性牙髓炎后,大鼠全身麻醉后取仰臥位固定于操作臺上,0.5%碘伏消毒口腔及口周后,BR-49球鉆在水冷卻下,在頭戴式放大鏡的幫助下于大鼠雙側上頜第一磨牙咬牙合面擴大穿髓孔,磨除冠髓,每個磨牙切髓時均使用全新及同一批次的BR-49球鉆以預防切髓過程中產熱不均勻對牙髓炎癥產生影響。術中密切觀察,及時吸凈口腔內的水以防止引起窒息死亡,術后觀察大鼠麻醉后蘇醒、日常活動以及飲水進食情況。無菌棉球止血,在沒有壓力的情況下,含有20 μl TIMP-1(200 ng/ml)(TIMP-1組)或20 μl生理鹽水(NS組)的無菌棉球直接覆蓋髓腔5 min。玻璃離子粘固劑修復空洞。于切髓給藥后24或48 h處死大鼠,每組4只大鼠。取上頜骨,分為左右兩半,4%多聚甲醛外固定48 h,組織切片HE及免疫熒光染色。

1.5 組織病理學分析將組織置于在EDTA脫鈣液中進行25 ℃恒溫脫鈣4周左右,脫水包埋。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機,沿磨牙近遠中方向平行于牙體長軸制作連續切片,厚4 μm。切片HE染色,光學顯微鏡觀察。牙髓炎癥的病理學評價及評分參照表1[5-6],評估包括根髓炎性細胞反應、根髓組織形態改變、根髓壞死范圍。

表1 根髓組織病理學分析評分表

1.6 免疫熒光染色將切片與初級抗體孵育,在切片上滴加使用PBS以1 ∶100稀釋配好的一抗CD68,二抗CY3山羊抗rab以1 ∶300稀釋。使用了DAPI染液進行細胞核染色。

1.7 統計學處理應用IBM SPSS 23.0 統計分析軟件對HE染色切片各實驗組牙髓組織炎癥評分進行統計分析;免疫熒光染色切片經CaseViewer 2.4.0軟件掃描,Image J軟件分析熒光強度,應用IBM SPSS 23.0 統計分析軟件對各實驗組免疫熒光強度進行統計分析。統計數據采用多因素方差分析,按α=0.05水準,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不可復性牙髓炎模型的建立光學顯微鏡下觀察大鼠牙髓組織切片。髓腔開放6 h:穿髓孔附近可見輕微炎癥細胞浸潤及成牙本質細胞層輕微紊亂(圖1A);髓腔開放12 h:穿髓孔附近牙髓組織全層紊亂裂解(圖1B);髓腔開放24 h:可見冠髓中有微膿腫形成,周圍見炎癥浸潤帶,冠髓組織約1/2紊亂裂解(圖1C);髓腔開放36 h:冠髓可見局部微膿腫,清晰的炎癥分界線,冠髓組織約2/3紊亂裂解(圖1D);髓腔開放48 h:可見微膿腫,大部分冠髓組織紊亂裂解,周圍出現炎癥界限(圖1E);髓腔開放72 h:大范圍的冠髓組織液化壞死,局部形成較大膿腫,周圍可見清晰的炎癥分界線(圖1F)。髓腔開放24、36、48 h時牙髓組織表現出典型的不可復性牙髓炎的表現,且炎癥局限于冠髓,選擇這三個開放時長進行后續實驗。

圖1 部分不可復性牙髓炎模型的組織學表現 HE ×50A:髓腔開放6 h;B:髓腔開放12 h;C:髓腔開放24 h;D:髓腔開放36 h;E:髓腔開放48 h;F:髓腔開放72 h;箭頭:指示炎癥分界線

2.2 根髓組織學定量分析VPT術后根髓HE染色的典型例子如圖2所示,組織病理學定量分析結果如表2、3所示,TIMP-1組根髓炎性細胞反應、根髓組織形態及根髓壞死范圍的炎癥評分與NS組炎癥評分之間的差異有統計學意義,TIMP-1組炎癥評分更高(P<0.001,P<0.001,P<0.01)。結果顯示,與NS組相比,TIMP-1組的根髓組織炎癥改變更加明顯,且根髓組織的炎癥改變隨著開放時長及給藥時長的增加而逐漸明顯。

圖2 VPT術后根髓HE染色 ×200

表2 根髓組織病理學評分多因素方差分析

表3 根髓組織病理學評分多重比較分析

2.3 免疫熒光染色分析VPT術后根髓免疫熒光染色的典型例子如圖3所示,CD68免疫熒光強度多因素方差分析見表4、5。TIMP-1組根髓組織的CD68免疫熒光標記較NS組明顯,熒光強度高于NS組,差異有統計學意義(F=110.37,P<0.001),且隨著開放時長及給藥時長的延長,根髓組織中的免疫熒光標記強度也逐漸明顯增加。

圖3 VPT術后根髓免疫熒光染色(CD68標記) ×200

表4 CD68免疫熒光強度多因素方差分析

表5 CD68免疫熒光強度多重比較分析

3 討論

臨床上,深齲露髓診斷為不可復性牙髓炎的患牙難以判斷細菌及炎癥侵入其牙髓組織的深度,因此進行組織學研究具有重要意義。本實驗試圖尋找一種可行的抗炎藥物以提高不可復性牙髓炎VPT成功率,采用了動物實驗性牙髓炎模型,模擬臨床治療程序,在炎癥牙髓中應用TIMP-1,并進行了組織病理學觀察和免疫組化分析,了解VPT術后剩余根髓的炎癥進展,為臨床治療提供依據。

TIMP-1是1975年發現的一種分泌分子,是MMP-9的天然抑制劑,通過與MMP-9形成抑制性復合物來防止ECM分解[2],TIMP-1還可以限制中性粒細胞的過度聚集,以防止活性氧和蛋白酶的過度產生,保護組織免受降解[7]。此外,TIMP-1還具有細胞因子樣活性,參與調節細胞的增殖、凋亡、分化和血管生成[8]。TIMP-1在人體多種系統的炎癥疾病中發揮著重要的作用,例如TIMP-1在哮喘過敏性肺部炎癥中發揮調節炎癥、參與組織重塑的保護作用[9]。TIMP-1與牙周組織的破壞和修復也密切相關,慢性牙周炎患者經牙周治療后TIMP-1表達增加,提示通過提高TIMP-1的表達可能會改善牙周治療的結果[10]。以上研究提示TIMP-1是一個潛在的抗炎藥物。

研究顯示TIMP-1在一些疾病如哮喘過敏性肺部炎癥中發揮抗炎促修復的作用[9],但是在某些疾病如慢性肝炎中又發揮促炎作用[11]。Glaab et al[12]在大鼠毒性研究中發現TIMP1mRNA的表達上調與組織變性和壞死相關,Kobuch et al[13]發現TIMP-1水平的升高會導致肝臟中性粒細胞的增加,這些研究結果也與本實驗所觀察到的TIMP-1加重了牙髓炎的結果相吻合。有研究[10]顯示不同濃度的TIMP-1對體外培養的人牙周膜細胞的增殖與堿性磷酸酶活性表達的影響不同,牙周膜細胞增殖與堿性磷酸酶活性表達隨著TIMP-1濃度的增高出現先增高然后又降低的趨勢,濃度過高時還會抑制牙周膜細胞增殖與堿性磷酸酶活性表達,推測其濃度可能會影響TIMP-1在炎癥中的作用。

本項研究采用了一種動物模型。大鼠磨牙牙體組織結構與人類磨牙較為相似,而且其牙髓組織在受到損傷時,炎癥與修復過程與人類牙髓組織受損后的反應相似,所以選擇大鼠磨牙進行實驗的研究越來越多[14]。通過髓腔暴露法建立了一個范圍明確可控的牙髓炎模型,解決了臨床上不能準確評估牙髓炎癥范圍的治療難題。此外,本實驗還具有一定的創新性,首先由于TIMP-1目前在口腔方向應用的研究較少,僅有一項將TIMP-1作為蓋髓藥物在大鼠健康牙髓中應用的實驗[4],在該實驗中TIMP-1的濃度為200 ng/ml,本研究作為一項前瞻性的研究就選擇了相同的濃度進行實驗,但是本實驗選取的是牙髓炎癥模型,因此在后續實驗中可以設置濃度梯度實驗,分析TIMP-1的濃度是否對其在炎癥牙髓中的作用產生影響。其次,該文獻應用TIMP-1進行蓋髓實驗時,使用明膠海綿作為載體,吸取TIMP-1溶液后蓋髓,本實驗進行了嘗試發現使用明膠海綿會導致玻璃離子充填空間不足或充填后易脫落,因此本實驗將這一步改進成牙髓止血后用吸取TIMP-1的無菌棉球覆蓋牙髓斷面5 min進行給藥。