GRB2 rs8082005、RXRA rs3849222位點(diǎn)與延邊地區(qū)EOPE易感性的關(guān)系

蔡宛軒,劉 霞,金 光,董春玉,楊恩月

子癇前期(preeclampsia,PE)影響全球2%～8%的孕婦,是孕婦圍產(chǎn)期死亡的主要危險(xiǎn)因素之一,對(duì)母嬰健康有著極大威脅[1-3]。PE以34周作為基本界限,分為早發(fā)型子癇前期(early-onset preeclampsia,EOPE)和遲發(fā)型子癇前期(late-onset preeclampsia, LOPE)。明確EOPE的發(fā)病機(jī)制對(duì)開(kāi)展疾病的早期預(yù)防和干預(yù)至關(guān)重要。遺傳因素在EOPE的發(fā)病中影響重大。尋找并確定PE的遺傳易感基因,對(duì)了解疾病發(fā)病機(jī)制以及更好地開(kāi)展疾病的預(yù)防與干預(yù)工作至關(guān)重要[4]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)一方面是遺傳標(biāo)志物,另一方面還會(huì)顯著影響到易感性及預(yù)后。

生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,GRB2), 通過(guò)調(diào)控受體酪氨酸激酶(receptor yrosine kinase,RTK)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞的功能[3]。相關(guān)報(bào)道指出,RXRA實(shí)際位于ADIPO通路,人RXRA的實(shí)際位置則是染色體9q34.3,其為RXR的重要成員[5-7]。

1 材料與方法

1.1 病例資料本實(shí)驗(yàn)選擇延邊地區(qū)居住10年以上,且2015年3月開(kāi)始在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院和延邊婦幼保健院住院部診斷為EOPE、無(wú)其他疾病的382例患者中隨機(jī)選取192例作為實(shí)驗(yàn)組;此外,隨機(jī)選取同期在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院和延邊婦幼保健院自然分娩的192例健康人群作為對(duì)照組。所有受試者均簽署知情同意書。本研究已通過(guò)倫理審查。審批文書號(hào):YB.No20180823。

1.2 SNP的選擇通過(guò)Regulome-DB數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI-SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(MAF>10、LD值:r2<0.8)、Hapmap-SNP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與EOPE相關(guān)的28個(gè)基因和134個(gè)Regulome-SNP位點(diǎn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,28個(gè)基因和134個(gè)Regulome-SNP位點(diǎn)中GRB2rs8082005、RXRArs3849222位點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.3 血樣收集及DNA提取、測(cè)序收集患者和健康人清晨的空腹外周血液至枸緣酸鈉抗凝劑試管,并在-20 ℃低溫冰柜(青島海爾集團(tuán))儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｌ崛NA時(shí)按照全血DNA提取試劑盒(日本KURABO公司)說(shuō)明書通過(guò)全血核酸提取儀Quick Gene-810(日本KURABO公司),采用分光光度計(jì)Nano Drop-2000(美國(guó)伯騰儀器有限公司)測(cè)定DNA樣本的濃度及污染度。合格標(biāo)準(zhǔn):濃度>20 ng/μl,A260/A280:1.65～1.85。將合格的DNA樣本送到北京華大基因公司進(jìn)行以MassARRAY SNPS質(zhì)譜為基礎(chǔ)的基因分型。

1.4 PCR-RFLP與基因分型運(yùn)用相應(yīng)的引物設(shè)計(jì)軟件,以及對(duì)應(yīng)的Primer Premier 5.0,進(jìn)而完成相關(guān)引物。設(shè)計(jì)引物原則為:將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增范圍控制在150～300 bp并且不能含有自身互補(bǔ)序列避免產(chǎn)生引物二聚體;發(fā)卡結(jié)構(gòu)以及G+C含量應(yīng)在40%～60%之間(表1)。依靠查詢軟件來(lái)尋求適宜的限制性內(nèi)切酶,來(lái)實(shí)現(xiàn)酶切斷的效果(表2)。采用Sequenom MassARRAY?質(zhì)譜的基因分型法及PCR-RFLP,開(kāi)展相應(yīng)的基因分型操作。

表1 位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物序列及條件

表2 限制性內(nèi)切酶設(shè)計(jì)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析,驗(yàn)證資料是否匹配采用相應(yīng)的H-W平衡律,P>0.05說(shuō)明群體代表性和可比性;運(yùn)用t檢驗(yàn)方法,對(duì)比病例組、對(duì)照組的年齡(P>0.05)差異;運(yùn)用Logistic回歸分析對(duì)比病例、對(duì)照組的基因型方面的區(qū)別,運(yùn)用TYPER 4.0軟件分析樣本波峰圖。

2 結(jié)果

2.1 rs3849222、rs8082005 SNP分型峰值圖檢測(cè)樣本為RXRArs3849222 CC型,則只有C堿基對(duì)應(yīng)分子量位置有峰,而T堿基對(duì)應(yīng)分子量處無(wú)峰。見(jiàn)圖1。檢測(cè)樣本為RXRArs3849222 TC型,則T堿基對(duì)應(yīng)分子量位置有峰,C堿基對(duì)應(yīng)分子量位置也有峰。見(jiàn)圖2。測(cè)樣本為RXRArs3849222 TT型,則只有T堿基對(duì)應(yīng)分子量位置有峰,而C堿基對(duì)應(yīng)分子量處無(wú)峰。見(jiàn)圖3。檢測(cè)樣本為GRB2rs8082005 CC型,則只有C堿基對(duì)應(yīng)分子量位置有峰,而T堿基對(duì)應(yīng)分子量處無(wú)峰。見(jiàn)圖4。檢測(cè)樣本為GRB2rs8082005 TC型,則T堿基對(duì)應(yīng)分子量位置有峰,C堿基對(duì)應(yīng)分子量位置也有峰。見(jiàn)圖5。測(cè)樣本為GRB2rs8082005 TT型,則只有T堿基對(duì)應(yīng)分子量位置有峰,而C堿基對(duì)應(yīng)分子量處無(wú)峰。見(jiàn)圖6。

圖1 RXRA rs3849222 CC基因型

圖2 RXRA rs3849222 TC基因型峰值圖

圖3 RXRA rs3849222 TT基因型峰值圖

圖4 GRB2 rs8082005 CC基因型峰值圖

圖5 GRB2 rs8082005 TC基因型峰值圖

圖6 GRB2 rs8082005 TT基因型峰值圖

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)本研究納入患者及正常對(duì)照組各192例,經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析表明納入研究對(duì)象的基因型分布頻率均符合哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)(χ2=0.613,P=0.456),提示所研究位點(diǎn)符合在人群中的分布規(guī)律,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所選的研究對(duì)象來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w,具有群體代表性和可比性。

2.3 兩組基本資料的比較本實(shí)驗(yàn)中共選擇實(shí)驗(yàn)組女性192例(100%),對(duì)照組女性192例(100%)。經(jīng)t檢驗(yàn)分析,兩組在年齡分布比例差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 多態(tài)性與易感性的關(guān)系實(shí)驗(yàn)組中GRB2rs8082005 TT、TC、CC基因型分別占比43.8%(84/192)、50.0%(96/192)、6.2%(12/192),對(duì)照組中GRB2rs8082005 TT、TC、CC基因型分別占比37.0%(71/192)、46.4%(89/192)、16.6%(32/192)。經(jīng)非條件Logistic回歸分析,與攜帶TT、TC基因型患者相比,攜帶CC基因型患者更易罹患EOPE(OR=3.155,95%CI=1.513～6.579,P=0.002);在隱性模型中,相比于TT+TC基因型攜帶者,攜帶CC基因型患者EOPE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=3.000,95%CI=1.495～6.022,P=0.002)。實(shí)驗(yàn)組中RXRArs3849222TT、CT、CC基因型分別占比9.9%(19/192)、54.7%(105/192)、35.4(68/192),對(duì)照組中rs3849222 TT、CT、CC基因型分別占比21.9%(42/192)、39.6%(76/192)、38.5(74/192)。經(jīng)非條件Logistic回歸分析,與攜帶CC基因型患者相比,攜帶TT基因型患者更易罹患EOPE(OR=2.031,95%CI=1.077～3.820,P=0.028);在隱形模型中,相比于攜帶CC+TC基因型患者,攜帶TT基因型患者增加EOPE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.549,95%CI=1.421～4.573,P=0.002)。綜上所述,通過(guò)Logistic回歸分析證實(shí)了SNPs攜帶(GRB2rs8082005 CC或RXRArs3849222 TT)更容易罹患EOPE,見(jiàn)表3。

表3 GRB2 rs8082005、RXRA rs3849222基因型頻率分布

2.5 基因多態(tài)性對(duì)攜帶不同基因型患者發(fā)生EOPE的影響在聯(lián)合基因型分析中,GRB2rs8082005 CC、RXRArs3849222 TT基因型為危險(xiǎn)基因型,所以每個(gè)個(gè)體的危險(xiǎn)基因型數(shù)在0到2之間(0、1、2),最終得出,與危險(xiǎn)基因數(shù)0個(gè)相比,攜帶危險(xiǎn)基因數(shù)1個(gè)和攜帶危險(xiǎn)基因數(shù)2個(gè)差異具備統(tǒng)計(jì)價(jià)值(P<0.001)。危險(xiǎn)基因型數(shù)量與EOPE的發(fā)病率呈正相關(guān),攜帶1個(gè)或2個(gè)危險(xiǎn)基因型的患者較不攜帶危險(xiǎn)基因型患者更容易患病EOPE。(調(diào)整OR=2.779,95%CI=1.665～4.639,P<0.001;調(diào)整OR=5.175,95%CI=1.080～24.794,P=0.04)。見(jiàn)表4。

表4 危險(xiǎn)基因型個(gè)數(shù)與EOPE易感性的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

早發(fā)型子癇前期是所有子癇前期病例中最嚴(yán)重的臨床類型,占所有子癇前期病例的 5%～20%,并且與新生兒的發(fā)病率和病死率有關(guān)[8],它的病情進(jìn)展快,存在不可預(yù)測(cè)性,危害高于LOPE[9-10]。如McGinnis et al[11]報(bào)告,全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS),鑒定SNP與子癇前期有顯著相關(guān)性深入分析其發(fā)病原理,尋找高效的預(yù)防方法,設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的治療措施,必然會(huì)成為病癥的研究熱點(diǎn)。EOPE發(fā)生可能與多個(gè)基因參與有關(guān),而遺傳因素在該疾病的發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色。

GRB2作為銜接蛋白,與體內(nèi)多種酪氨酸激酶依賴性信號(hào)通路有關(guān),因?yàn)楠?dú)特的自身結(jié)構(gòu),在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),又與胃癌、結(jié)腸癌、肝癌的遷移侵襲力相關(guān)[12]。王亞楠[13]發(fā)現(xiàn),GRB2基因rs9907177(C>T)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病存在易感性,攜帶GRB2rs9907177(C>T)CT和TT組合的基因型人群患HDP的風(fēng)險(xiǎn)高于攜帶CC基因型人群。本論文也研究分析GRB2,結(jié)果表明GRB2rs8082005攜帶C等位基因較TT+TC基因型患者增加患EOPE風(fēng)險(xiǎn)。本課題組曾研究過(guò)GRB2的SNP,結(jié)果可能由于鉑類藥物作用于GRB2rs1044228位點(diǎn),影響GRB2復(fù)合物介導(dǎo)相關(guān)的EGFR等信號(hào)通路,導(dǎo)致攜帶GRB2rs1044228CC基因型非小細(xì)胞肺癌患者生存期更長(zhǎng)。

ADIPOQ屬于內(nèi)皮保護(hù)因子,能夠增加胰島素敏感性、減少心血管疾病、抑制巨噬細(xì)胞的活性及炎癥因子TNF-α的表達(dá),具有良好的抗炎作用,能有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生生物活性因子[14]。血管內(nèi)皮損傷是EOPE發(fā)病的主要環(huán)節(jié),TNF-α可促進(jìn)其他因子損傷內(nèi)皮細(xì)胞,從而降低內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌及增加內(nèi)皮素的釋放,使許多臟器功能嚴(yán)重受損,導(dǎo)致EOPE的發(fā)病[15]。EOPE孕婦血清ADIPOQ水平明顯降低,且其病情越重,ADIPOQ水平降低越明顯,可能與ADIPOQ水平下降所致抗炎、抗氧化能力不足、滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)障礙加劇、血管內(nèi)皮功能下降、NO合成不足等機(jī)制有關(guān)[16]。由于RXRA位于ADIPO通路,會(huì)受到影響。因此該研究分析了RXRArs3849222位點(diǎn)與延邊地區(qū)孕婦EOPE易感性關(guān)系,結(jié)果表明RXRArs3849222位點(diǎn)SNP與延邊地區(qū)孕婦患EOPE風(fēng)險(xiǎn)存在明顯相關(guān)性,且攜帶T和CC+TC等位基因相比攜帶C等位基因型患者增加患EOPE風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,GRB2rs8082005(C>T)、RXRArs3849222(T>C)可能是EOPE的易感因素,影響妊娠期高血壓的發(fā)生。由于EOPE是由遺傳因素導(dǎo)致的妊娠期疾病,受多個(gè)基因、位點(diǎn)的調(diào)控,且環(huán)境、飲食、生活方式等也會(huì)對(duì)其發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[17]。該研究有一些局限性,如研究樣本選擇來(lái)自吉林省延邊朝鮮族自治州,這可能造成了選擇偏倚并影響了結(jié)果。后續(xù)研究中,可聯(lián)合多地區(qū)、多民族收集樣本進(jìn)一步研究RXRA、GRB2基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系,明確是否存在地域影響。