基于線粒體COI基因對棘胸蛙養殖群體的遺傳多樣性分析

張燕萍 章海鑫 習宏斌 吳子君 廖再生

文章編號：1006-3188（2023）04-001-05

摘要：為研究江西省棘胸蛙的遺傳多樣性，利用線粒體COI分子標記對采自江西省內峽江、靖安、金溪、明月山、于都5個棘胸蛙養殖群體144個樣本進行遺傳多樣性分析。結果顯示：144條棘胸蛙線粒體COI長度為990bp，共檢測出變異位點270個，包括簡約信息位點250個，單突變位點20個，2個缺失和插入；共檢測到35個不同的單倍型，單倍型多樣性為0.927；核苷酸多樣性為0.0405，平均核苷酸差異數（K）為40.018。養殖群體除峽江和于都群體的遺傳多樣性較高，其余3個群體均較低；群體內發生了極大的分化，群體變異主要來源于群體內（78.08%）。

關鍵詞：棘胸蛙；COI；養殖群體；遺傳多樣性

中圖分類號：Q959.53；S966.3文獻標識碼：A

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）又名石蛙、石雞等，屬脊椎動物門、兩棲綱、無尾目、叉舌蛙科、棘胸蛙屬［1］，具有肉質細嫩、味道甘美、營養豐富的特點，而且具有較高的經濟和科研價值，所以受到越來越多的人關注。為了滿足市場需求及保護野生資源，江西20世紀80年代初開始人工養殖棘胸蛙，人工養殖過程中近親繁殖，導致我省棘胸蛙出現生長速度慢、抗病力差、個頭小等問題，缺乏對養殖群體進行遺傳多樣性分析。

細胞色素氧化酶亞基I（Cytochrome coxidase subunit I，COI）是線粒體中13個蛋白編碼基因之一，該基因功能比較保守，同時又有一定的進化速率，包含的遺傳進化信息量較大，在物種內變異較小，種間變異較大，很少存在插入和缺失，且容易被通用引物所擴增，所以在水生生物種群遺傳多樣性及遺傳結構分析、系統發育等發面得到了廣泛應用［2-3］。

本研究基于線粒體DNACOI，對江西省內5個棘胸蛙養殖群體進行遺傳多樣性與遺傳結構分析，旨在為解決棘胸蛙人工養殖過程中由于遺傳多樣性下降而導致養殖效益降低的現狀，同時為我省棘胸蛙的品種選育與改良工作提供理論基礎，為棘胸蛙種質資源恢復與可持續利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

棘胸蛙采自江西省吉安地區峽江群體（XJ）22尾、宜春地區明月山群體30尾、宜春地區靖安群體32尾、贛州地區于都群體30尾、撫州地區金溪群體30尾。共計144尾，剪肌肉用95%乙醇保存，運回實驗室，-20℃冷凍保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取少量棘胸蛙的肌肉，利用生工生物工程（上海）有限公司提供的動物基因組提取試劑盒提取。提取后的DNA利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，-20℃冷凍保存備用。

1.2.2 PCR擴增

用于線粒體COI通用引物，引物序列為F（5′–GAAAGACGGGCCTTGATCCC–3′）和R（5′–GCCATTGAGAGGAGTACAGGG–3′），送至上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增體系為：10×buffer（MgCl2）2.5μL，dNTP（mix）（10mmol/L）1μL，引物（10mmol/L）各1μL，模板DNA（50ng/L）2μL，Taq DNA Polymerase（5U/μL）0.2μL，加超純水至25μL。PCR反應程序：95℃預變性5min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸 30 s，10個循環；95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30個循環；72℃ 延伸 10 min，4℃保存。

1.2.3 PCR產物檢測和測序

PCR產物取5μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的長度和濃度合格后，將PCR產物送往生工生物工程（上海）有限公司純化與雙向測序，測序引物同上。

1.3 數據處理與分析

測得的上下游序列利用DNA序列用SeqMan軟件進行拼接并手工校對。Clustal W（1.83）軟件［4］分析比對；利用DNAsp 5.0［5］軟統計單倍型及變異位點（S）、計算單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異（K）等多樣性參數。用MEGA（version 6.0）軟件［6］中的Kimura雙參數法計算各單倍型間的遺傳距離；采用NJ（Neighbor-joining）法，Bootstrap置信值估算重復次數1000次，對基因序列數據進行系統分析。用Ariequin3.11［7］軟件計算兩兩群體間的分化指數（Fst），進行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。

2 結果與分析

2.1 棘胸蛙COI基因序列PCR擴增

PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1。由圖1可知，棘胸蛙COI序列條帶電泳圖譜條帶清晰、明亮，線粒體COI序的片段大于1000bp。這可說明提取的棘胸蛙肌肉DNA質量較高，能夠用于后期的群體遺傳學研究（見圖1）。

2.2 棘胸蛙線粒粒體COI序列特征

序列經比對后，獲得的棘胸蛙樣品的線粒體COI序列長度為990bp，檢測到插入和缺失位點2個，檢測到變異位點270個，其中簡約信息位點250個，單突變位點20個（圖2）。堿基平均含量：A（27.1%）、T（31.3%）、G（16.8%）和C（24.8%），A+T含量（58.4%）顯著高于G+C含量（41.6%），表現為明顯的堿基組成偏倚性，與一般脊椎動物線粒體DNA序列特征基本一致。

2.3 單倍型分析

基于5個棘胸蛙養殖群體144條COI序列，共界定出35種單倍型，結果見表1，各群體包含單倍型類型差異較大，于都群體分布的單倍型最多（13種）、金溪群體分布的單倍型最少（9種）。分布最廣泛的Hap_5、Hap_6以及Hap_9單倍型分別出現為15次、29次和13次，其中Hap_6為共有單倍型。

2.3 遺傳多樣性分析

群體內的遺傳多樣性可以通過單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數等數據來體現。通過DnaSP5軟件計算各群體的遺傳多樣性參數見表2。144個樣本合計，單倍型多態性（Hd）為0.927，核苷酸多樣性（Pi）為0.04050，5個養殖群體的Pi值均超過0.01，說明這五個養殖群體的變異程度均較大；平均核苷酸差異數（K）為40.018，各群體平均核苷酸差異在21.060～39.391。

2.4 遺傳結構

通過利用MEGA 4.0軟件中的Kimura 2-parameter模型，計算出5個棘胸蛙群體之間以及群體內部的遺傳距離（D），結果如表3所示。5個棘胸蛙養殖群體內的遺傳距離在0.025～0.049之間分布，內部平均遺傳距離為0.045。在5個養殖群體中，遺傳距離最近的為于都群體和金溪群體，遺傳距離最遠的為明月山群體和靖安群體。

2.5 遺傳差異及遺傳分化

通過運用Arequin 3.5軟件計算5個棘胸蛙養殖群體的遺傳分化，結果見表4。結果表明棘胸蛙兩兩群體間遺傳分化系數（FST）值在0.00382～0.40090之間，其中宜春地區的明月山群體（MY）與宜春地區靖安群體（JA）發生的遺傳分化最大，而與撫州地區金溪群體（JX）發生的遺傳分化最小，YD、MY、JA群體間，JA與JX群體間，XJ與JA群體間均發生極大的分化（FST>0.25，P<0.001），但XJ與YD及JX群體間遺傳分化處于中等水平（0.1

利用AMOVA軟件進行棘胸蛙群體間和群體內的遺傳變異分析，分析結果如表5所示。分析結果顯示，5個棘胸蛙養殖群體中，群體間的變異為27.92%，群體內的變異為72.08%，群體內的變異明顯大于群體間的變異，表明變異主要來自棘胸蛙群體內部。

2.6 單倍型系統進化樹

基于COI基因序列的棘胸蛙群體的單倍型數據，構建NJ系統發育樹，見圖3。35個單倍型分成4個單系，獨有單倍型hap14、hap15、hap35形成一小單系，屬于明月山和金溪群體；獨有單倍型hap1、hap2、hap7、hap18、hap19、hap20、hap21、hap23、hap24、hap26、hap29和共享單倍型hap16、hap22形成一大單系，屬于于都、峽江、靖安群體。共享單倍型hap9、hap13、hap5、hap25、hap11和獨有單倍型hap34形成一單系，屬于峽江、明月山、金溪、靖安群體。其他單倍型聚為一大單系，來自所有群體。

3 討論

3.1 棘胸蛙的序列特征

本文中5個144尾棘胸蛙群體mtDNACOI基因序列中，堿基A、T、G、C的平均含量分別為27.1%、31.2%、16.8%、24.8%，5個群體中A+T堿基的平均含量（58.4%）大于G+C堿基平均含量（41.68%），在水產動物中此類現象比較常見，符合脊椎動物mtDNA堿基組成分布不均一的特點［8］。

3.2 棘胸蛙的遺傳多樣性

本試驗中測定的棘胸蛙5個群體的COI序列中共檢測270個變異位點，占全部序列的27.27%，共定義了35個單倍型。本研究中單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數分別為0.927、0.0405，與路慶芳［9］（2008）研究的野生群體（Hd：0.968，Pi：0.1168）相比，Hd和Pi均有下降，這一點與魏朝宇［10］研究的養殖群體（Hd：0.94568，Pi：0.0341）比野生群體低的結果一致。養殖群體遺傳多樣性下降，可能是因為人工養殖過程中，存在近親繁殖的現象，導致養殖群體遺傳多樣性下降。

3.3 棘胸蛙群體的遺傳變異

根據COI序列變異得到的NJ系統進化樹結果顯示（圖3），共享單倍型hap6分布于5個群體中，所含樣本數最多29個，推測為古老單倍型。總體來說，江西省各個縣區棘胸蛙養殖群體的單倍型呈現出一種混雜的分布格局，錯綜交織。

群體間的遺傳分化指數（Fst）用來表示群體間的遺傳分化程度，Fst值越大，表明兩個群體間的分化程度越高；反之，分化程度越低［8］。根據各群體的Fst值，判斷峽江與于都群體間、明月山與靖安群體間遺傳分化很小，可以忽略不計；峽江與明月山、金溪群體間遺傳分化處于較高水平；明月山與于都、靖安群體間，于都與靖安、金溪群體間，靖安與金溪群體間遺傳分化很大。

群體間的遺傳距離能反映群體間的親緣關系，值越大親緣關系越疏遠。利用MEGA軟件計算群體間遺傳距離（表3），XJ與YD（0.034）、XJ與JX（0.035）、JX與MY（0.037）之間的遺傳距離較小，表明親緣關系較近，而MY與YD、JA 2群體間的遺傳距離較遠，說明MY群體與YD群體及JA群體之間的親緣關系較遠。

參考文獻

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［9］ 路慶芳.利用線粒體DNA分子標記探討棘胸蛙種群遺傳結構［D］.浙江師范大學，2008.

［10］魏朝宇.棘胸蛙養殖群體遺傳多樣性評價及其應用分析［D］.貴州大學，2022.

基金項目：江西省重點研發計劃項目（20192BBF60023）

作者簡介：張燕萍（1979-），女，博士，主要從事水產養殖、漁業資源與漁業生態環境研究。E-mail：zhangyanpingxie@163.com.