復合益生菌對幼鯢生長及免疫指標的影響試驗

周韶輝 解宜興 毛盼 王丞 王曉清 周先文 魏營

文章編號：1006-3188（2023）04-017-04

摘要：本研究旨在研究復合益生菌對幼鯢生長及免疫指標的影響。隨機選取體質(zhì)健康、體重100g/尾左右的2齡幼鯢，分別添加占基礎(chǔ)餌料重量0.20%、0.40%、0.60%的配比復合益生菌進行拌料投喂試驗，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置三個重復組，共12組，試驗期180d。試驗結(jié)束時測定各組大鯢的生長及攝食指標、血液生理生化指標及血清抗氧化酶及非特異性免疫指標，結(jié)果顯示三個試驗組大鯢終末體重、平均增重率、特定生長率均顯著高于對照組，指標數(shù)據(jù)說明以復合益生菌拌料投喂有利于大鯢的生長；中劑量組及高劑量組大鯢血液中的總蛋白（TP）及白蛋白（ALB）含量均顯著高于對照組及低劑量組；試驗組大鯢血清中酸性磷酸酶（ACP）均高于對照組，這顯示出復合益生菌拌料投喂對大鯢的非特異性免疫有促進作用；中劑量組及高劑量組大鯢血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著性高于對照組及低劑量組。結(jié)果表明，復合益生菌（芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌）添加日常餌料重量0.40%、0.60%的配比中劑量、高劑量組不僅能促進大鯢的生長發(fā)育，同時還能促進大鯢對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而增強體質(zhì)，提升疾病抵抗力。

關(guān)鍵詞：復合益生菌；幼鯢；免疫指標

中圖分類號：S966.6文獻標識碼：A

中國大鯢擁有極高的科研及經(jīng)濟價值，已在我國已形成規(guī)模化養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，我國大鯢養(yǎng)殖業(yè)越來越受困于病害的影響，尤其是細菌性、真菌性和病毒性疾病給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于傳統(tǒng)的化學類和抗生素類藥物毒性較大，不僅容易使病原微生物產(chǎn)生耐藥性，還嚴重污染水環(huán)境，因此尋找可以替代藥物的免疫添加劑正逐漸成為本領(lǐng)域的研究熱點。水產(chǎn)動物益生菌的主要作用機制包括免疫促進、抑菌、營養(yǎng)促進等［1］，本研究開展復合益生菌制劑對大鯢生長及免疫力的影響，以期對大鯢的疫病綠色防控提供更有效的方法，對大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和資源保護具有重要的積極意義。接下來主要就針對復合益生菌對幼鯢生長及免疫指標的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

湖南張家界大鯢國家級自然保護區(qū)事務中心。

1.2 試驗時間

2022年01月-2022年06月，試驗期共計180d。

1.3 試驗材料

復合益生菌由吉首大學微生物實驗室提供，該復合益生菌為30%芽孢桿菌、30%酵母菌、40%乳酸菌組成的菌液，經(jīng)平皿菌落計數(shù)法測定，結(jié)果顯示活菌總數(shù)為5×109CFU/mL。供試大鯢由湖南張家界大鯢國家級自然保護區(qū)事務中心提供，為規(guī)格100g/尾左右的2齡幼鯢。

1.4 試驗內(nèi)容

根據(jù)前期預試驗結(jié)果，設(shè)計單因素試驗考察以占基礎(chǔ)餌料不同配的復合益生菌拌料投喂，對大鯢生長指標及非特異性免疫指標的影響。

1.4.1供試大鯢的選擇與分組

隨機選取體質(zhì)健康、體重100g/尾左右的2齡幼鯢（幼鯢為卵黃完全消失，從開始主動攝食到外鰓完全消失的大鯢）48尾，分為對照組、復合益生菌拌料投喂低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組設(shè)3個重復，每個重復4尾大鯢。其中對照組：基礎(chǔ)餌料投喂；低劑量組：以基礎(chǔ)餌料重量0.20%配比復合益生菌拌料投喂；中劑量組：以基礎(chǔ)餌料重量0.40%配比復合益生菌拌料投喂；高劑量組：以基礎(chǔ)餌料0.60%配比復合益生菌拌料投喂。

1.4.2 試驗餌料組成

根據(jù)幼鯢階段生長需要，調(diào)整基礎(chǔ)餌料配方，以50%米蝦、50%大草魚切絲進行投喂。

1.4.3 生長及攝食指標的測定

試驗期間，記錄供試大鯢的初始體重及試驗結(jié)束時的體重、每日投餌量及殘餌量，計算試驗期內(nèi)大鯢體重增加量、平均增重率、餌料系數(shù)、特定生長率。具體計算公式如下：

體重增加量=W2－W1；

平均增重率=［（W2－W1）/W1］/n×100%；

餌料系數(shù)=（F1－F2）/（W2－W1）；

特定生長率=（lnW2－lnW1）/t×100%

式中，W1為大鯢的初始總重、W2為試驗結(jié)束時大鯢的總重，n為各個重復的樣本數(shù)，F(xiàn)1為總投餌量、F2為總殘餌量，t為實驗總天數(shù)。

1.4.4 血液生理指標和生化指標的測定

試驗結(jié)束時，對所有供試大鯢以無菌注射器進行尾靜脈采血，并將血樣注入到添加抗凝劑的采血管中，將血樣低溫保存，送至湖南張家界市人民醫(yī)院實驗室以全自動生化儀進行檢測。生理指標主要測定白細胞數(shù)（WBC）、紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白（Hb）及血小板總數(shù)（Plt）等，生化指標主要測定總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL-K）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、甘油三酯（TG）膽固醇（CHOL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）等。

1.4.5 血清抗氧化酶和非特異性免疫指標測定

試驗結(jié)束時，對所有供試大鯢以無菌注射器進行尾靜脈采血，采集到的血液于4℃靜置2h后，再以4000r/min離心10min，取上清液，即為血清。分別以試劑盒測定待測血清中的酸性磷酸酶（ACP）、過氧化氫酶（CAT）及SOD（超氧化物歧化酶）等抗氧化酶和非特異性免疫指標。具體方法如下：

（1）ACP的測定采用酸性磷酸酶試劑盒，其活力單位定義為：100mL血清或1g組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用30min產(chǎn)生1mg酚為一個金氏單位；

（2）CAT的測定采用過氧化氫酶測定試劑盒，其活力單位定義為：1mL或1mg組織每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個活力單位；

（3）SOD的測定采用總SOD試劑盒，其中以血清為樣品，活力單位定義為1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量。

1.4.6 發(fā)病率及成活率統(tǒng)計

試驗期間密切觀察各組大鯢的生長情況，如發(fā)生病害感染應及時采取隔離措施，并對病鯢進行疾病診斷及治療。試驗結(jié)束時，統(tǒng)計各組大鯢各類病害發(fā)生情況、死亡數(shù)，計算發(fā)病率、死亡率及成活率。

1.5 飼養(yǎng)管理

將供試大鯢養(yǎng)殖于陰涼避光處，養(yǎng)殖水源為寶峰湖湖水，水溫保持在20～25℃之間，溶解氧＞6.0mg/L，pH值為6.5～7.5。餌料經(jīng)消毒后于每日18：00投喂，次日08：00撈出殘餌，分別記錄每日各組的投餌量與殘餌量。

1.6 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件處理后，用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P＜0.01表差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合益生菌拌料投喂對大鯢生長性能的影響

由統(tǒng)計分析（見表1）可知，試驗結(jié)束時，三個試驗組大鯢終末體重、平均增重率、特定生長率均顯著高于對照組（P＜0.05），說明以復合益生菌拌料投喂有利于大鯢的生長；三個試驗組之間終末體重、平均增長率、特定生長率差異不顯著（P＞0.05）；四個組別的餌料系數(shù)均無顯著性差異；四組試驗大鯢均未出現(xiàn)死亡。

2.2 復合益生菌拌料投喂對大鯢血液生理指標的影響

由統(tǒng)計分析（見表2）可知，試驗結(jié)束時，四組大鯢血液中的白細胞數(shù)（WBC）、紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白（Hb）以及血小板總數(shù)（Plt）均無顯著性差異（P＞0.05），說明復合益生菌拌料投喂對大鯢血液生理指標無不利影響。

2.3 復合益生菌拌料投喂對大鯢血液生化指標的影響

由統(tǒng)計分析（見表3）可知，試驗結(jié)束時，中劑量組及高劑量組大鯢血液中的總蛋白（TP）及白蛋白（ALB）含量均顯著高于對照組及低劑量組（P＜0.05），但中劑量組與高劑量組之間、對照組與低劑量組之間總蛋白（TP）及白蛋白（ALB）含量差異不顯著（P＞0.05）；四組大鯢血液中的總膽紅素（TBIL-K）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）堿性憐酸酶（ALP）含量均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 復合益生菌拌料投喂對大鯢血清抗氧化酶和非特異性免疫指標的影響

由統(tǒng)計分析（見表4）可知，試驗結(jié)束時，四組大鯢血清中的酸性磷酸酶（ACP）及過氧化氫酶（CAT）活性均無顯著性差異（P＞0.05），但試驗組大鯢血清中酸性磷酸酶（ACP）均高于對照組，這顯示出復合益生菌拌料投喂對大鯢的非特異性免疫或有促進作用；中劑量組及高劑量組大鯢血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著性高于對照組及低劑量組（P＜0.05），但中劑量組與高劑量組之間、低劑量組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 復合益生菌拌料投喂對大鯢發(fā)病率及成活率的影響

由統(tǒng)計分析（見表5）可知，試驗結(jié)束時，所有組別的大鯢均無死亡；其中對照組發(fā)病率為16.67%，低劑量組發(fā)病率為8.33%，中劑量組及高劑量組發(fā)病率均為0；經(jīng)診斷，所有患病大鯢所患疾病均為水霉病。

3 討論

益生菌是通過定殖在動物體內(nèi)，改變宿主某一部位菌群組成的一類對宿主有益的活性微生物。研究表明，益生菌能促進水生動物生長性能及免疫力提升，減少病害的發(fā)生，從而降低生產(chǎn)成本。此外，益生菌還可改善水體環(huán)境，從而使養(yǎng)殖獲得較好的社會效益和經(jīng)濟效益［2］。

相較于單一益生菌，近年來復合型益生菌的應用日益增多，與添加單一益生菌相比，在飼料中添加復合益生菌對降低腸道細菌數(shù)量、調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物腸道菌群平衡、改善腸道菌群組成等具有更好的促進作用［3］。

本研究以芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌組成的復合益生菌拌料投喂大鯢，結(jié)果顯示，試驗組大鯢的生長性能得到有效提升。血液中的總蛋白由白蛋白和球蛋白組成，良好的營養(yǎng)狀態(tài)可以使上述指標維持在較高水平。試驗結(jié)果顯示，以占日常餌料配比0.40%、0.60%的復合益生菌拌料投喂大鯢，能使得大鯢血液中總蛋白、白蛋白顯著高于對照組，說明合理添加量的益生菌的使用能促進大鯢對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而增強其體質(zhì)［4］。

另外，試驗結(jié)果還顯示，以復合益生菌拌料投喂的大鯢相較對照組大鯢血液中酸性磷酸酶（ACP）活性得到顯著提升，這顯示出復合益生菌拌料投喂對大鯢的非特異性免疫或有促進作用。

此外，試驗期間對照組及低劑量組部分大鯢體表出現(xiàn)灰白色菌絲，并伴隨表皮潰爛及少量出血，部分病鯢表現(xiàn)出焦躁不安、在飼養(yǎng)池內(nèi)急速游動等狀態(tài)，經(jīng)診斷，確定上述大鯢感染水霉病。對照組與中、高劑量組發(fā)病率的差異進一步證實了適量以添加芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌組成的復合益生菌拌料投喂，對增強大鯢體質(zhì)有一定的促進作用［5］。

綜上所述，以芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌組成的復合益生菌拌料投喂不僅能在一定程度上促進大鯢的生長發(fā)育，同時還能在一定程度上促進大鯢對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而增強其體質(zhì)，提升其疾病抵抗力。但由于本試驗使用的為成品復合益生菌，因此對三種單一菌種之間的協(xié)同或拮抗作用機理尚不清楚，還有待進一步研究。

參考文獻

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［4］周韶輝，解宜興，周先文，等.枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒對稚鯢生長及免疫指標的影響試驗［J］.中國水產(chǎn)，2020（11）：74-77.

［5］周韶輝.中草藥與益生菌對大鯢生長及免疫的影響研究［D］.湖南農(nóng)業(yè)大學，2020.

*通訊作者：魏營（1983-）男，工程師，野生動植物保護與利用 E-mail：zsh78718@163.com