正交試驗(yàn)優(yōu)化黑米原花青素的提取工藝及其抗氧化性研究

吳春燕,蔡敏,廖如櫻

(廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 崇左 532200)

黑米是一種特殊的大米,包括香米、色米和專用米[1]。黑米的色素可當(dāng)作一種天然安全可靠、綠色健康的活性物質(zhì),得到人們的青睞,具備廣泛的研發(fā)價(jià)值與應(yīng)用前景[2-3]。黑米表面皮存在有原花青素[4]。原花青素是一類多酚類化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)也很復(fù)雜,還具有較強(qiáng)的抗氧化活性和自由基能力。研究表明,從天然產(chǎn)物中提取的原花青素具有抗衰老作用[5],改善尿路感染所致膀胱損傷、抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫作用[6],減輕胰腺組織氧化應(yīng)激、炎癥損傷[7],以及抗疲勞[8]、抑制視網(wǎng)膜新生血管的產(chǎn)生[9]、抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞[10]作用。

目前原花青素的提取的方法有:溶劑提取法[11]、低共熔溶劑提取法[12]、超聲波提取法[13]、微波提取法[14]、酶提取法[15]及以上結(jié)合方法[16-18],本研究采用溶劑提取法提取黑米中的原花青素,為黑米的提取開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(Tmstandard公司);黑米,購于崇左市國寶超市;香草醛,L(+)抗壞血酸,鹽酸,乙酸乙酯,無水甲醇,30%過氧化氫,硫酸亞鐵,七水,丙酮,無水乙醇,水楊酸,石油醚,成都市科隆化學(xué)品有限公司;DPPH,麥克林公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海閑德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;SHZ-95B循環(huán)水式多用真空泵,河南省予華儀器有限公司;分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;FW100高速萬能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司;A560紫外可見分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司;HK-2A超級(jí)恒溫恒水水浴,南京南大萬和科技有限公司;HXLG-10-50DG真空冷凍干燥機(jī),上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

制備原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液:準(zhǔn)確稱取20 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醇溶解后置50 mL容量瓶中,再加入乙醇溶液稀釋定容到刻度,搖勻,配制成為0.4 mg/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液,避光放置儲(chǔ)存,作為儲(chǔ)備液使用。

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]:準(zhǔn)確移取0.4 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,再加乙醇溶液定容稀釋到刻度,配制成質(zhì)量濃度為0.04,0.08,0.12,0.16,0.20 mg/mL的原花青素乙醇溶液。

分別移取2.0 mL不同濃度的原花青素乙醇溶液于10 mL容量瓶中,再加入3.0 mL顯色劑放到不同濃度的10 mL容量瓶中,以乙醇溶液定容至刻度,充分混勻后,避光靜置60 min。將乙醇溶液代替樣品溶液調(diào)零做空白對(duì)照試驗(yàn),在500 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。再根據(jù)樣品溶液濃度與吸光度的關(guān)系,以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(x),測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)(y),繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得到回歸方程。

1.3.2 花青素提取率的計(jì)算

(1)

式中:C為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出測(cè)定樣液的濃度,mg/mL;V為提取液總體積,mL;V0為定容體積,mL;V1為取樣量體積,mL;m為原料質(zhì)量,g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱取黑米粉末1.00 g,加入一定量的丙酮溶劑,在水浴下提取一定時(shí)間的提取物,離心,得到提取液。再加入3.0 mL顯色劑,用乙醇定容稀釋到刻度,充分搖勻后,靜置60 min,再以紫外可見分光光度計(jì)500 nm處測(cè)定黑米原花青素的吸光度。固定料液比1∶30(g∶mL),丙酮體積分?jǐn)?shù)為60%,水浴溫度55 ℃,提取時(shí)間50 min。考查料液比、丙酮體積分?jǐn)?shù)、水浴溫度、提取時(shí)間對(duì)黑米原花青素提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交表,見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 乙酸乙酯萃取

采用乙酸乙酯萃取[20],稱取黑米粉末置250 mL三角瓶中,按照正交驗(yàn)證最佳工藝條件下進(jìn)行水浴提取三次,合并濾液得提取液。將提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至50 mL,加入100 mL石油醚置分液漏斗靜置分層,下部成水層由下端放出,上層石油醚由上端倒出,萃取三次。水層、乙酸乙酯層按1∶2體積比萃取三次,于旋蒸儀中減壓濃縮,經(jīng)真空冷凍干燥設(shè)備中冷凍干燥24 h,得到黑米原花青素提取物,從而得出黑米原花青素提取純度為60.15%。

1.3.6 抗氧化性的研究

1.3.6.1 原花青素提取液對(duì)DPPH·的清除能力測(cè)定[21]

DPPH配制:準(zhǔn)確稱取5 mg DPPH置于250 mL容量瓶中,再用無水乙醇溶解并定容稀釋到刻度,搖勻即得質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的DPPH溶液,避光保存。

原花青素樣品及對(duì)照品抗壞血酸配制:先配制5 mg/mL母液樣品,準(zhǔn)確移取母液1,2,3,4,5,6 mL分別置于25 mL容量瓶中,再用乙醇溶液稀釋定容到刻度,進(jìn)行搖勻即可,使其樣品質(zhì)量濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL。

分別準(zhǔn)確移取不同濃度的黑米原花青素提取液2.0 mL置于10 mL比色管中,再加入2.0 mL DPPH溶液,進(jìn)行搖勻,避光靜置30 min,在517 nm處波長下進(jìn)行測(cè)定其吸光度A1。同時(shí)準(zhǔn)確移取不同濃度的黑米原花青素提取液2.0 mL,再加入2.0 mL無水乙醇,進(jìn)行搖勻,避光靜置30 min,在517 nm處波長下測(cè)定其吸光度A2。另準(zhǔn)確移取2.0 mL純化水和2.0 mL DPPH溶液反應(yīng)作參比,進(jìn)行混合均勻后,在避光靜置30 min,在517 nm處測(cè)定其吸光度A0。平行測(cè)定3次,取平均值?？瞻捉M用無水乙醇代替,對(duì)照組用等濃度的抗壞血酸代替計(jì)算樣品對(duì)DPPH的清除率。

(2)

式中:A0為純化水與DPPH混合液的吸光度;A1為樣品與DPPH混合液的吸光度;A2為樣品溶液與無水乙醇混合液的吸光度。

1.3.6.2 原花青素提取液對(duì)·OH的清除能力測(cè)定[22]

H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH,一般情況下·OH存活時(shí)間短反應(yīng)活性高。當(dāng)在反應(yīng)體系中加入水楊酸,可以快速捕獲·OH并生成紫色化合物(2,3-二羥基苯甲酸),在510 nm處有較大的吸收峰。

原花青素樣品及對(duì)照品抗壞血酸配制:先配制5 mg/mL母液樣品,準(zhǔn)確移取母液1,2,3,4,5,6,7 mL分別置于25 mL容量瓶中,再用乙醇溶液稀釋定容到刻度,進(jìn)行搖勻,使其樣品質(zhì)量濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mg/mL。分別準(zhǔn)確移取1 mL不同樣品濃度的黑米原花青素溶液置于10 mL比色管中,加入2 mL 6 mmoL/L FeSO4溶液、再加入2 mL 6 mmoL/L H2O2溶液,進(jìn)行搖勻后,室溫下靜置10 min后,再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,進(jìn)行搖勻即得,靜置30 min,空白組用純化水代替,對(duì)照組用抗壞血酸代替,測(cè)定510 nm處下的吸光度A1。以純化水代替上述原花青素的樣品溶液,步驟同上,測(cè)定得吸光度A0。同時(shí)準(zhǔn)確移取不同濃度的黑米原花青素提取液1 mL置于10 mL比色管中,加入2 mL 6 mmoL/L FeSO4溶液、再加入2 mL純化水,進(jìn)行搖勻,室溫下靜置10 min后,再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,進(jìn)行搖勻,靜置30 min,在510 nm處測(cè)定吸光度A2。平行測(cè)定3次,取平均值,計(jì)算樣品中原花青素·OH的清除率。

(3)

式中:A0為檢測(cè)液不含原花青素的吸光度;A1為樣品加過氧化氫溶液的吸光度;A2為樣品不加過氧化氫溶液的吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.3.1的方法,以橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度(mg/mL),縱坐標(biāo)為吸光度(A),進(jìn)行原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?？傻镁€性回歸方程為:y=0.479 8x-0.022 9(R2=0.999 1)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)黑米原花青素提取率的結(jié)果分析

從圖1可看出,在料液比1∶15 ～1∶30(g∶mL)時(shí),料液比逐漸增大,原花青素的提取率上升,料液比為1∶30(g∶mL)時(shí),原花青素的吸光度達(dá)到最大值。料液比繼續(xù)增加,原花青素的提取率降低。因此,確定最佳料液比為1∶30(g∶mL)。

圖1 料液比對(duì)黑米原花青素提取率的影響

2.2.2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑米原花青素提取率的結(jié)果分析

在圖2中,隨著提取丙酮體積分?jǐn)?shù)的增加,原花青素提取率的趨勢(shì)先增加后下降,丙酮體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),原花青素提取率最高。當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí),相應(yīng)的水離子減少,即溶出的原花青素提取率會(huì)減少。因此,最佳丙酮體積分?jǐn)?shù)選擇為60%。

圖2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑米原花青素提取率的影響

2.2.3 時(shí)間對(duì)黑米原花青素提取率的結(jié)果分析

由圖3可知,提取時(shí)間從30 min到50 min時(shí),原花青素提取率上升,當(dāng)提取時(shí)間超過50 min之后,原花青素提取率降低,可能是由于時(shí)間過長會(huì)使原花青素分解,造成提取率降低。因此,確定50 min作為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黑米原花青素提取率的影響

2.2.4 溫度對(duì)黑米原花青素提取率的結(jié)果分析

由圖4可知,原花青素提取率也隨溫度升高而升高,當(dāng)溫度達(dá)高于55 ℃時(shí),繼續(xù)升高溫度提取,提取率下降。因此,選擇提取最佳溫度55 ℃。

圖4 溫度對(duì)黑米原花青素提取率的影響

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,研究料液比(A)、丙酮體積分?jǐn)?shù)(B)、水浴溫度(C)、提取時(shí)間(D)四個(gè)因素對(duì)黑米原花青素提取率的影響,結(jié)果如表2所示。

表2 黑米原花青素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,各個(gè)因素的極差順序?yàn)镽A>RD>RC>RB,故料液比對(duì)原花青素提取率影響最大。最佳組合為A3B2C2D3,最佳提取工藝為料液比1∶35(g∶mL),丙酮體積分?jǐn)?shù)60%,提取溫度55 ℃、提取時(shí)間60 min。對(duì)最佳提取工藝做驗(yàn)證試驗(yàn),重復(fù)3次,得出黑米中原花青素的平均提取率為0.531 2%。

2.4 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 黑米原花青素對(duì)DPPH·的清除作用

由圖5可以看出,在選定濃度范圍內(nèi),黑米原花青素對(duì)DPPH·具有清除能力,隨著濃度的增加,DPPH·的清除能力也逐漸增強(qiáng),在相同條件濃度下,抗壞血酸略高于黑米原花青素對(duì)DPPH·的清除能力。

圖5 黑米原花青素對(duì)DPPH·的清除作用

2.4.2 黑米原花青素對(duì)·OH的清除作用

由圖6可知,在選定濃度范圍內(nèi),隨著濃度的升高黑米原花青素與抗壞血酸對(duì)·OH清除的清除率均呈上升趨勢(shì),可見,在相同條件濃度下,抗壞血酸略高于黑米原花青素對(duì)·OH的清除能力。

圖6 黑米原花青素對(duì)·OH的清除作用

3 結(jié)論

黑米中含有的花青素對(duì)人體有益,黑米具有較大的開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用前景。本文采用溶劑提取法提取黑米中原花青素,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了丙酮體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溫度、料液比對(duì)黑米原花青素提取率的影響,得出黑米中原花青素的最佳工藝條件為丙酮體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間60 min、料液比1∶35(g∶mL)、提取溫度55 ℃,黑米原花青素提取率是0.531 2%,純度為60.15%。采用DPPH清除能力和·OH清除能力衡量黑米中原花青素的抗氧化性,試驗(yàn)表明,黑米中的原花青素可以有效清除DPPH和·OH,提取的原花青素有較好的抗氧化性。本研究為黑米的提取開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。