大蒜抑菌性能及穩定性研究

高曉娟,張俊嬌,劉光鵬,曲艷萍,李紅翠

(1.齊魯理工學院 生物與化學工程學院,山東 濟南 250200;2.中華全國供銷合作總社 濟南果品研究院,山東 濟南 250200)

1 實驗材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大蒜:市售,無芽,無蟲變,于冰箱保存。

指示菌種(由齊魯理工學院微生物學實驗室提供):

有害指示菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉;

有益指示菌:乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、地衣芽孢桿菌。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、氯化鈉、酵母浸粉、MRS培養基、溴甲酚綠乙醇溶液、乙酸鈉、蔗糖、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鈉、檸檬酸等生物試劑。

1.2 主要儀器設備

高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-SⅡ型,上海博訊實業有限公司醫療設備廠)、單人超凈工作臺(SW-CJ-1D型,蘇州凈化設備有限公司)、隔水式恒溫培養箱(GNP-9080型,上海精宏實驗設備有限公司)、電熱恒溫水溫箱(HHW.21型,北京永光明醫療儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大蒜汁制備

大蒜,去皮,于榨汁機中榨成汁,再于離心機中3 000 r/min離心20 min,取上清液作為原液。

1.3.2 供試菌懸浮液制備

分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌斜面菌種于50 mL LB液體培養基內,取乳酸桿菌于50 mL BCG牛乳液體培養基內,取保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌于50 mL MRS液體培養基內,取黑曲霉、毛霉菌于50 mL PDA液體培養基內,分別于37和30 ℃搖床培養24～48 h。

1.3.3 不同條件下抑菌實驗

因老白皮大蒜是日常生活中較為常見的大蒜品種,因此,1.3.3.1～1.3.3.6的實驗均選用老白皮大蒜汁進行。

1.3.3.1 抑菌預實驗

采用管碟擴散法[12]:無菌條件下,分別取100 μL細菌菌懸液和霉菌菌懸液于無菌LB培養基和PDA培養基平板中,涂布均勻備用。用無菌鑷子夾取無菌牛津杯放于上述培養基表面,使其與培養基盡量接觸。分別取200 μL大蒜汁于牛津杯中,同時用無菌水做對照實驗。完成上述操作后,將培養皿分別放入37和30 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h后取出,測量每個抑菌圈直徑。4種有害指示菌按上述標準操作,同時做4組平行實驗。

1.3.3.2 大蒜汁濃度抑菌影響實驗

采用二倍稀釋法:用生理鹽水把大蒜汁稀釋成濃度為50%,25%,12.5%,6.25%的大蒜汁稀釋液,按照1.3.3.1中的方法,測定不同濃度大蒜汁的抑菌效果。

1.3.3.3 pH值對大蒜汁抑菌影響實驗

實驗采用濾紙片擴散法,分別移取pH值為2.6,3.6,4.6,5.6,6.6,7.6的磷酸緩沖液各4 mL,與等量大蒜汁原液混合均勻,用無菌鑷子夾取在不同pH值大蒜汁中浸泡5 min后的濾紙片,分別放在4種有害指示菌平板上。同時,用無菌水做對照實驗,恒溫培養后,測量抑菌圈直徑,觀察pH值對大蒜汁抑菌效果的影響。

1.3.3.4 溫度對大蒜汁抑菌影響實驗

宋軍霞等[13]人研究發現,在一定范圍內,隨著熱處理溫度升高,大蒜汁抑菌作用逐漸增強,但當超過一定溫度后,大蒜汁抑菌作用逐漸減弱甚至失去抑菌活性。實驗采用管碟擴散法,取6支試管各取4 mL大蒜汁,分別放入35,45,55,65,75 ℃的恒溫水浴鍋中進行熱處理,處理時間為30 min,按1.3.3.1中的方法觀察溫度對大蒜抑菌效果的影響。

1.3.3.5 儲存時間對大蒜汁抑菌影響實驗

將老白皮大蒜汁原液在室溫下避光保存,以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌,每間隔一天做一次抑菌實驗,連續5 d,按照1.3.3.1中的方法測定抑菌圈直徑大小,觀察儲存時間對大蒜汁抑菌效果的影響。

1.3.3.6 大蒜汁對環境微生物的抑制實驗

該實驗采用自然沉降法:分別取6個無菌LB和PDA固體培養基平板,放在實驗臺上,打開皿蓋,3個LB培養基表面上噴上老白皮大蒜汁,另三個噴上無菌水做對照實驗。6個PDA培養基作同樣處理,過夜后,蓋上皿蓋,置于恒溫培養箱中倒置培養24～48 h,觀察培養皿內微生物生長情況。

1.3.3.7 不同類型大蒜抑菌效果的影響實驗

實驗選用新鮮紫皮大蒜、新鮮白皮大蒜、老紫皮大蒜、老白皮大蒜4種不同類型大蒜汁,分別在37和70 ℃水浴處理30 min后,研究不同溫度下不同類型的大蒜對不同類型微生物的抑制效果。

抑菌實驗采用濾紙片擴散法:取20 μL不同類型的大蒜汁于無菌濾紙片上,晾干后放于不同指示菌的固體培養基平板中,輕壓濾紙片,使其貼合在培養基上。同樣操作,用無菌水做對照實驗。37 ℃恒溫培養,48 h后用直尺測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 大蒜汁對不同微生物的抑菌效果

對4種典型有害指示菌的抑菌預實驗,實驗結果如表1和圖1所示。

圖1 大蒜汁對4種指示菌的抑菌結果圖

表1 大蒜汁對4種有害指示菌的抑菌效果

實驗結果如表1和圖1所示:大腸桿菌的抑菌圈最大,說明大蒜汁對其抑制效果最好;對金黃色葡萄球菌的抑制效果次之,但是抑菌圈明顯;黑曲霉和毛霉的抑菌圈較小;因此,通過實驗證明大蒜汁對細菌的抑菌效果更顯著。

2.2 大蒜汁濃度對抑菌效果的影響

4種濃度對4種有害指示菌的抑菌結果如圖2所示:大蒜汁的濃度越高,對4種微生物的抑菌效果越好,濃度越低,抑菌效果顯著降低。不同濃度的大蒜汁對大腸桿菌的抑菌作用強于金黃色葡萄球菌、黑曲霉和毛霉;對毛霉的抑制效果最弱,當濃度降到25%時,就沒有明顯抑菌圈;濃度降到12.5%時,黑曲霉無明顯抑菌圈,但與對照組相比,大蒜汁周圍的霉菌孢子的生成量及菌絲濃度明顯降低。

圖2 不同濃度大蒜汁對指示菌抑制效果

2.3 不同pH值對大蒜汁抑菌效果的影響

利用緩沖液對大蒜汁進行pH值調整后再進行的抑菌實驗,結果由圖3可以看出,隨pH值的升高大蒜汁對于細菌的抑制效果呈現出先降低再升高再降低的趨勢,說明酸性條件下,大蒜對于細菌抑制效果較強;而對于霉菌呈現出先降低后升高的趨勢。可在后續研究中,繼續升高pH值,觀察堿性條件下對霉菌的最佳抑制pH值。

圖3 不同pH值大蒜汁對指示菌抑制效果

2.4 溫度對大蒜汁抑菌效果的影響

利用不同溫度熱處理的大蒜汁對4種有害指示菌的抑菌效果不同,實驗結果如圖4所示。當溫度高于35 ℃時,抑菌效果明顯減弱,溫度越高抑菌效果越弱。通過實驗可以確定最適抑菌溫度是35 ℃。當處理溫度高于55 ℃時,處理后的大蒜汁對黑曲霉和毛霉的抑菌實驗,沒有明顯抑菌圈;被75 ℃處理后,大蒜汁對金黃色葡萄球菌沒有明顯抑菌圈現象。這說明當溫度高于75 ℃甚至更高時,大蒜汁的抑菌活性基本消失,這可能是由于高溫破壞了大蒜中的抑菌活性成分而失去抑菌活性。后續實驗可以增加低溫到35 ℃之間的溫度梯度,研究低溫對抑菌效果的影響。

圖4 不同溫度下處理過的大蒜汁對指示菌抑制效果

2.5 儲存時間對抑菌效果的影響

不同儲存時間的大蒜汁對指示菌的抑制結果如圖5所示,實驗結果說明,隨著儲存時間的增加,大蒜的抑菌效果逐漸減弱,在存儲5 d后,檢測不到抑菌圈。

圖5 大蒜汁的儲存時間對指示菌的抑制效果

2.6 大蒜汁對環境微生物的抑制效果

通過培養噴灑大蒜汁與無菌水的培養基平板后,實驗結果如圖6和圖7所示,兩圖中上層平板為噴有大蒜汁的實驗組,下層平板為無菌水的對照組。對比結果可以明顯看出,在噴有大蒜汁的平板上微生物菌落較少,對照組平板上微生物的長勢明顯,所以大蒜汁對環境中的微生物具有明顯的抑制作用。

圖6 PDA培養基菌落生長情況

圖7 LB培養基菌落生長情況

2.7 不同類型大蒜的抑菌效果

37和70 ℃水浴處理后的不同大蒜汁對不同微生物進行的抑菌實驗結果如表2和表3所示。

表2 37 ℃下大蒜液對不同指示菌的抑菌效果

表3 70 ℃下大蒜液對不同菌種的抑菌效果

實驗結果說明,37 ℃大蒜汁對5種指示菌均有顯著抑制效果,其中,4種不同類型的大蒜均對大腸桿菌的抑制效果最顯著,老紫皮大蒜的抑菌效果最好,新鮮白皮大蒜的抑菌效果最弱;對益生菌中的地衣芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌的抑制效果更強;70 ℃大蒜汁對指示菌的抑菌效果較弱,高溫使大蒜的抑菌活性降低,通過比較實驗數據可以看出,大蒜對有害菌的生長影響比對有益菌的生長影響要大。

3 結論

通過實驗結果可知,大蒜對細菌的抑制效果要強于霉菌;不同濃度的大蒜汁對微生物的抑制效果不同,濃度越高,抑菌效果越明顯;不同pH環境,大蒜抑菌效果不同,在偏酸性環境中對指示細菌抑制效果更好,在偏酸或偏堿條件下對指示霉菌抑制效果較好;通過熱處理實驗說明,溫度超過35 ℃以后,隨著溫度的升高,大蒜的抑菌活性逐漸降低甚至消失;大蒜汁隨著儲存時間的增加,抑菌效果逐漸減弱;通過研究大蒜對腐敗微生物的生長影響,可為大蒜在食品防腐保鮮中的應用提供指導。

通過研究大蒜對乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、地衣芽孢桿菌4種益生菌的影響,結果表明,大蒜對益生菌具有一定抑制效果,尤其是對保加利亞乳桿菌和地衣芽孢桿菌的抑制效果較強,建議人們在食用含有益生菌保健品或食品時,盡量減少大蒜的攝入,尤其是減少生食老紫皮大蒜。若必須攝取大蒜,可通過食用加熱處理后的大蒜,并在攝取大蒜后立即飲水,使腸胃中的大蒜得到適當的稀釋,以減少大蒜對益生菌生長的抑制,使得補充益生菌的作用得到最大發揮。