UPLC-MS/MS法測定米拉貝隆中EDCI

王玉如,盧忠秋,蘭公劍

(南京正大天晴制藥有限公司,江蘇 南京 210046)

米拉貝隆是首個治療膀胱過度活動癥(OAB)的β3-腎上腺素受體激動劑類藥物,與治療OAB的一線藥物抗膽堿能藥相比,該藥安全性較高,具有良好的應用前景[1]。2011年9月在日本首次上市,2012年6月美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市[2-4]。米拉貝隆的合成工藝是以2-氨基噻唑-4-乙酸、對硝基苯乙胺鹽酸鹽和R-扁桃酸為起始物料,經縮合、還原和縮合等反應生成,在縮合工藝中用到1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亞胺(EDCI)縮合劑,含有碳二亞胺類遺傳毒性警示結構[5]。遺傳毒性雜質是指在微量的水平下能誘導DNA發生突變的雜質,具有潛在的致癌性,威脅人類的健康[5-8],已被廣泛關注及嚴格控制。因此有必要建立一種米拉貝隆中EDCI的檢測方法。目前國內外關于EDCI檢測的研究較少,對米拉貝隆中EDCI的測定未見報道[9-10]。根據國際藥品注冊技術協調會議(ICH)M7、美國FDA、歐洲EMA和中華人民共和國藥典(四部)關于基因毒性雜質的指導原則等要求[11-13],遺傳毒性雜質的毒理學關注閾值(Threshold of Toxicological Concern,TTC)為1.5 μg/d。米拉貝隆緩釋片最大日劑量為50 mg,所以米拉貝隆中EDCI的限度為30 mg/kg,限度較低,且該雜質紫外吸收較弱,采用普通液相色譜方法滿足不了靈敏度要求。液相色譜-質譜聯用技術具有靈敏度高、分析速度快及結果準確可靠等特點[14-16],可以滿足痕量雜質檢測的要求。本研究首次建立了超高效液相色譜串聯質譜法(Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS),可準確、靈敏地測定米拉貝隆原料藥中基因毒性雜質EDCI的殘留量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1290超高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);6470三重四極桿質譜儀(安捷倫科技有限公司);MSA6.6S電子分析天平(賽多利斯-上海貿易有限公司);ME802E電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);XSE205DU 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試藥

乙酸銨(LC/MS級別,上海安譜科技有限公司);乙腈(HPLC級,默克股份有限公司);EDCI對照品(批號:MB20060501,純度:99.8%,蘇州昊帆生物股份有限公司);米拉貝隆原料藥(批號:144190601、144190602、144190603,南京正大天晴制藥有限公司)。

2 方法與結果

2.1 方法條件

2.1.1 色譜條件

液相色譜柱Agilent ZORBAX Bonus-RP(150×4.6 mm,3.5 μm);流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液,流動相B為乙腈;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;進樣體積10 μL;流動相梯度見表1,六通閥切換設置:6 min設置進入廢液。

表1 流動相梯度

2.1.2 質譜條件

電噴霧離子源(Electrospray Ionization Source,ESI); 采用多反應監測(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式,正離子模式檢測;EDCI離子對及相關參數見表2。離子源參數:干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流速5 L/min;鞘氣溫度250 ℃;鞘氣流速11 L/min;霧化器壓力45 psi;噴嘴電壓500 V;毛細管電壓3 500 V。

表2 EDCI離子對及相關參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液

取EDCI對照品適量,精密稱定,置量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解并定量稀釋制成每1 mL約含300 ng的溶液,作為對照品貯備液。

2.2.2 對照品溶液

精密量取對照品貯備液適量,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50] 定量稀釋制成每1 mL約含30 ng的溶液,作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

取米拉貝隆約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=90∶10]溶解并定量稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗

分別精密量取溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]、對照品溶液和供試品溶液(批號:144190601)各10 μL,按照上述色譜條件和質譜條件進行試驗,記錄色譜圖,試驗結果見圖1。溶劑和供試品溶液均不干擾EDCI的測定,表明本方法的專屬性良好。

圖1 專屬性試驗TIC色譜圖

2.3.2 線性關系試驗

精密量取“2.2.1”項對照品貯備液適量,分別用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解并定量稀釋制成每1 mL約含3.0,15,24,30,45,60 ng(10%～200%限度濃度)的系列濃度的線性溶液,取各濃度的線性溶液,按“2.1”項下方法條件進樣,以EDCI的濃度為橫坐標(x),以EDCI的峰面積為縱坐標(y),進行線性回歸。回歸方程為:y=2 291.027 6x+1 295.825 1,r= 0.999 8。結果表明,EDCI在質量濃度3.03～60.56 ng/mL范圍內,線性關系良好。

2.3.3 定量限與檢測限試驗

取“2.2.1”項對照品貯備液適量,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]逐步稀釋,分別稀釋至信噪比S/N≥10為定量限溶液;至信噪比S/N≥3為檢測限溶液。結果該方法下EDCI的定量限質量濃度為0.18 ng/mL(相當于供試品質量濃度的0.18×10-6);平行測定6次峰面積RSD為5.2%(n=6);檢測限質量濃度為0.06 ng/mL(相當于供試品濃度的0.06×10-6),結果表明,定量限濃度明顯低于限度濃度的10%(3.00×10-6),方法靈敏度較好,符合檢測要求。

2.3.4 準確度試驗

取米拉貝隆樣品(批號:144190601)10 mg,精密稱定9份,置10 mL量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解,精密加入“2.2.1”項下對照品貯備液各0.50,1.00和1.50 mL,分別用溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為50%回收率溶液、100%回收率溶液和150%回收率溶液;每個濃度水平平行配制3份。按“2.1”項下方法條件檢測,結果表明,采用外標法計算,不同濃度水平,EDCID的回收率在83.43%～90.62%,滿足70%～130%的驗證要求,RSD為3.2%(n=9),表明該方法的準確度良好,見表3。

表3 準確度試驗

2.3.5 進樣精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液,連續進樣6針,記錄峰面積,結果峰面積的RSD為1.0%(n=6),保留時間RSD為0.1%(n=6),表明該儀器進樣精密度良好。

2.3.6 重復性試驗

取米拉貝隆樣品(批號:144190601)10 mg,精密稱定6份,置20 mL量瓶中,用溶劑[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解,分別精密加入“2.2.2”項下對照品貯備液1.00 mL,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為重復性溶液。依法測定,結果EDCI含量的RSD為2.2%<10%(n=6),表明該方法重復性良好。

2.3.7 中間精密度試驗

不同的分析人員在不同日期進行重復性試驗,照“2.3.6重復性”項下方法重新配制對照品溶液和6份加標供試品溶液,測定加標供試品溶液中雜質的含量,與重復性試驗結果計算12次測量結果的RSD。結果EDCI含量的RSD為3.8%(n=12),表明該方法中間精密度良好。

2.3.8 溶液穩定性

按照“2.2.2”和“2.2.3”項下溶液配制方法,分別配制對照品溶液和供試品溶液,在室溫條件放置0,4,10,14,16和19 h后測定,結果對照品溶液峰面積與0 h比值均介于79.5%～94.0%,供試品溶液中均未檢測出EDCI,結果對照品溶液和供試品溶液室溫放置19 h內穩定。

2.4 樣品測定

取3批樣品(批號:144190601、144190602、144190603),按“2.2.3”項下溶液配制方法配制供試品溶液,按“2.1”方法條件進樣測定,采用外標法以峰面積進行計算,3批米拉貝隆中均未檢測出EDCI。

3 結論

實驗采用了不同流速(0.9,1.0,1.1 mL/min),不同的柱溫(30,35,40 ℃)及不同的有機相比例(3%,5%,7%),結果表明,適當微調系統參數,對EDCI的測定均無影響。本方法具有專屬性良好、線性范圍寬、準確度良好和靈敏度高等特點,可用于米拉貝隆中EDCI的測定。