黃柏及黃柏酒炙品的薄層色譜鑒別方法的研究與改進

阮文輝,葉松華,馮夏珍,吳哲,薛潤苗,羅晉萍,許信學,王曉燕*

(1.山西省藥品審評中心(山西省醫藥與生命科學研究院),山西 太原 030006;2.山西省藥品檢查中心,山西 太原 030031;3.山西省食品藥品檢驗所,山西 太原 030031;4.山西華康藥業股份有限責任公司,山西 運城 044000)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥樹皮,習稱“川黃柏”,性苦,寒,歸腎、膀胱經,清熱燥濕,瀉火除蒸,解毒療瘡[1-3],主產地主要有四川、貴州、湖北、云南,以四川、貴州產量最大[4],現行《中華人民共和國藥典》(2020版)收載黃柏、鹽黃柏和黃柏炭,未收載酒黃柏,也無薄層色譜鑒別標準。但酒黃柏在我國應用廣泛,歷史悠久[5-7]。黃柏的酒制初載于唐代《銀海精微》[8],謂之:“酒柏”。清代《本草從新》[9]曰“生用降實火,炒黑止崩帶,酒制治上,蜜制治中,鹽制治下”。在常用方劑中生品多用于清熱劑,如“黃柏丸”(清腸止痢)[10]、“黃連解毒湯”(瀉火解毒)[11];酒制多用于清上焦熱,如“還睛丸”(清熱散風明目)[12]、“清上瀉火湯”(清虛熱散頭風)[13]。

薄層色譜鑒別一直是中藥材真偽快速鑒別的常用方法,具有設備要求低、操作簡便、檢測速度快,效率高、適用性強等優勢在中藥材快速鑒別中得到廣泛應用[14-17]。現有的黃柏、酒黃柏薄層鑒別方法如表1所示,本課題組多次嘗試采用《中國藥典》(2020年版)中所載方法進行黃柏和酒黃柏的薄層色譜鑒別,發現操作繁瑣,重復性較差,對實驗試劑質量和人員操作要求較高,加大了黃柏和酒黃柏快速鑒別的難度。本文嘗試對現行黃柏薄層色譜鑒別方法進行研究與改進,以期獲得操作較為簡單、檢測速度快、重復性好、穩定性高的薄層色譜鑒別方法,用于黃柏、酒黃柏飲片的質量控制。

表1 文獻報道黃柏、酒黃柏薄層鑒別方法

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

本實驗所用十五批黃柏藥材和三批關黃柏購自河北安國,經山西省藥檢所羅晉萍主任藥師鑒定分別為木蘭科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥樹皮和蕓香科植物黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)的干燥樹皮,信息見表2。

表2 黃柏飲片來源及制備

1.1.2 實驗儀器

XSR-205DU/AC型電子天平(瑞士METTLER);SB25-12DTD型超聲波清洗器(寧波新芝);CBIO21多功能暗箱式紫外分析儀(北京賽百奧);CY型滾筒式炒藥機(南京騰陽);雙槽層析缸(上海壘固)。硅膠G板(批號:020190411,煙臺江友);硅膠GF254板(批號:20061021,青島海洋);微量毛細管(1 μL,批號:889892;3 μL,批號:895254,德國,HIRSCHMANN)。

1.1.3 實驗試劑

鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-202015,中國食品藥品檢定研究院);鹽酸黃柏堿對照品(批號:111895-201805,中國食品藥品檢定研究院);黃柏對照藥材(批號:121510-201807,中國食品藥品檢定研究院);冀州黃酒(批號:20200806),石家莊欒城黃酒廠;甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);三氯甲烷、甲苯、異丙醇(分析純,天津市大茂化學試劑廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃柏炮制

文獻報道黃柏炮制方法多樣[18-21],本文參照國家及多省份中藥材炮制標準、中藥飲片廠通行酒黃柏炮制規范并采信老藥工的數十年酒黃柏炮制經驗,采用以下酒黃柏炮制方法:取黃柏絲100 kg,加黃酒10 kg拌勻,置罐或適宜的容器內悶潤60 min至酒盡,取出,炒干(品溫150～170 ℃),偶有焦斑,即得。

1.2.2 樣品溶液的制備及檢視

取藥材粉末 0.1 g,加甲醇5 mL,超聲提取(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,濾過,濾液用甲醇補足5 mL,作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1 g,同法制成對照藥材溶液。再另取鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿對照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對照品溶液,用毛細管點樣1～9 μL,展開、取出、晾干,置紫外燈(365 nm)下檢視。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜鑒別條件考察

2.1.1 薄層色譜鑒別提取溶劑考察

本實驗考察了提取溶劑分別為甲醇、乙醇、乙酸乙酯對酒黃柏1的提取效果的比較,見圖1。甲醇提取液熒光點的大小和強度最高,熒光點均勻且聚集,明顯高于乙醇和乙酸乙酯,甲醇作為提取溶劑利于提升檢測系統的靈敏度。

供試品溶液:1.甲醇;2.乙醇;3.乙酸乙酯;4.鹽酸黃柏堿對照品;5.鹽酸小檗堿對照品;點樣量:3 μL

2.1.2 薄層色譜鑒別展開系統考察

實驗對四種展開體系進行了考察,結果顯示,展開劑Ⅳ:乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺(V乙酸乙酯∶V甲醇∶V三氯甲烷∶V氨水∶V三乙胺=6∶2∶2∶1∶1)的熒光點集中清晰、不易漂移,且檢測精度較高,重復性較好。除出現了小檗堿的亮黃色熒光,還出現了藍色熒光和綠色熒光,見圖2。初步估計薄層色譜圖中綠色熒光點為黃柏酮類物質,藍色熒光點為木蘭花堿類物質的熒光所致,有待后續研究。

展開劑I:V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(水)=6∶3∶2∶1.5∶0.3;展開劑II:V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=30∶15∶4;展開劑III:V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(三氯甲烷)∶V(氨水)∶V(三乙胺)=6∶2∶2∶1∶1;供試品溶液:1.黃柏1;2.酒黃柏1;3.酒黃柏7;4.酒黃柏13;5.黃柏對照藥材;6.小檗堿對照品

2.1.3 薄層色譜鑒別提取方法考察

考察了回流和超聲兩種方法。超聲和回流提取效果無明顯差異,而且采用超聲提取法黃柏藥材中的標志性物質小檗堿(C20H18NO4)的提取率更高,所以后續試驗優選超聲提取法進行樣品溶液的制備。

2.1.4 薄層色譜鑒別展距考察

實驗考察了不同展距對展開效果的影響。結果顯示展距為7 cm時效果較好,拖尾現象少,隨著層析時間的延長,展距的加大,耗時、費板且溶劑前沿和熒光點容易產生漂移,對薄層板的加工要求和硅膠顆粒均勻度要求變高。

2.1.5 薄層色譜鑒別點樣量考察

點樣量1～2 μL時,熒光點集中,邊界清晰,拖尾少,能夠達到薄層色譜鑒別的要求。

2.2 薄層色譜鑒別專屬性考察

本方法的專屬性進行考察見圖3。

供試品溶液:1.黃柏1;2.酒黃柏1;3.黃柏對照藥材;4. 鹽酸黃柏堿對照品;5.鹽酸小檗堿對照品;點樣量:3 μL

鹽酸小檗堿有熒光斑點,黃柏對照藥材、黃柏、酒黃柏飲片在與鹽酸小檗堿對照品相同的位置有相同的熒光斑點,鹽酸黃柏堿無熒光斑點,且無其他干擾斑點。表明該方法專屬性良好。

2.3 薄層色譜鑒別耐用性考察

對不同廠家生產的高效薄層板和普通薄層板進行考察發現,樣品在普通板和高效板上均可獲得很好的分離,熒光點集中,且邊界清晰,而高效板的效果更優,更利于后續的薄層掃描定量。在溫度對薄層鑒別影響的考察中發現4和21 ℃條件下,小檗堿熒光點大小穩定,相對集中,邊界清晰且展距相當,在40 ℃條件下,展距有所增長,但影響較小,熒光點有較明顯變化,熒光點面積約為4 ℃時的兩倍,但邊界清晰,對黃柏和酒黃柏的薄層色譜鑒別未產生影響。

2.4 樣品的薄層色譜檢測

2.4.1 用《中國藥典》方法鑒別十五批黃柏飲片

按2020年版《中國藥典》薄層色譜方法進行十五批黃柏飲片薄層鑒別,經過多次試驗才得到較清晰的圖譜,見圖4。供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。但斑點有明顯的漂移,顯色不清晰,較分散。

提取溶劑:1%醋酸-甲醇溶液;提取方法:超聲處理;硅膠G板:煙臺市江友硅膠開發有限公司;展開劑:V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=30∶15∶4;展距:10 cm;供試品溶液:1～15:黃柏1～15;16.黃柏對照藥材;17.黃柏堿對照品;18.小檗堿對照品;點樣量:3 μL;檢視:稀碘化鉍鉀噴涂顯色

2.4.2 薄層鑒別十五批黃柏飲片

按本文方法層析、晾干、檢視,結果見圖5,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的亮黃色熒光斑點,斑點集中、均勻,邊界清晰,溶劑前沿和熒光點無明顯漂移。

供試品溶液:1～15.黃柏1～15;16.黃柏對照藥材;17. 小檗堿對照品;18.黃柏堿對照品

2.4.3 薄層鑒別十五批酒黃柏飲片

同法試驗、檢視,圖6顯示在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的亮黃色熒光斑點,斑點集中、均勻,邊界清晰,溶劑前沿和熒光點無明顯漂移。

供試品溶液:1～15:酒黃柏1～15;16. 小檗堿對照品;17. 黃柏對照藥材;18.黃柏堿對照品

2.4.4 薄層鑒別黃柏與關黃柏

同法對關黃柏和黃柏進行試驗、檢視。結果如圖7所示,關黃柏薄層色譜圖為上下兩個亮黃色熒光點,上面的亮黃色熒光點為小檗堿,下面的亮黃色熒光點極有可能為巴馬丁,有待后續研究,本薄層色譜鑒別方法可以快速鑒別黃柏與關黃柏。

供試品溶液:1.黃柏1;2.黃柏對照藥材;3～5.關黃柏1～3;6.小檗堿對照品

3 結論與討論

針對《中國藥典》(2020版)收載的黃柏藥材鑒別方法,本方法進行了如下改進:1)樣品粉末取樣量由0.2 g減少至0.1 g,本方法精度增加;2)提取溶劑由1%醋酸-甲醇溶液變更為甲醇,用量由40 mL減少為5 mL,溶劑用量大幅減少,且省去溶劑配置環節;3)《中國藥典》(2020版)收載黃柏藥材鑒別方法以三氯甲烷-甲醇-水(V三氯甲烷∶V甲醇∶V水=30∶15∶4)的下層溶液為展開劑,置氨蒸汽飽和的展開缸內,展開,步驟復雜而且斑點極易漂移,造成檢視判斷困難。改進后本方法展開劑為乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺(V乙酸乙酯∶V甲醇∶V三氯甲烷∶V氨水∶V三乙胺=6∶2∶2∶1∶1),不需要分層展開劑,展開劑現用現配,斑點集中、邊界清晰、穩定無漂移;4)《中國藥典》(2020版)收載方法操作時需要將薄層板置氨蒸汽中飽和的展開劑中展開,展開結束后需噴以稀碘化鉍鉀試液顯色后檢視,操作復雜,本方法置展開劑中展開結束后,直接在365 nm下檢視,方便直觀;5)本方法還可作為黃柏與關黃柏的快速薄層色譜鑒別之用,斑點分離清晰穩定。